Definiera genfunktioner i tumorigenes genom ex vivo-ablation av floxerade alleler i maligna perifera nervhöljestumörceller

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att utföra gen knockouts som är embryonala dödliga in vivo i genetiskt modifierade musmodell-härledda tumörer och sedan bedöma effekten som knockouten har på tumörtillväxt, proliferation, överlevnad, migration, invasion och transkriptomet in vitro och in vivo.

Abstract

Utvecklingen av nya läkemedel som exakt riktar sig mot nyckelproteiner i mänskliga cancerformer förändrar cancerbehandlingar i grunden. Men innan dessa läkemedel kan användas måste deras målproteiner valideras som terapeutiska mål i specifika cancertyper. Denna validering utförs ofta genom att slå ut genen som kodar för det terapeutiska målet i en genetiskt modifierad musmodell (GEM) av cancer och bestämma vilken effekt detta har på tumörtillväxt. Tyvärr begränsar tekniska problem som embryonal dödlighet i konventionella knockouts och mosaicism i villkorliga knockouts ofta detta tillvägagångssätt. För att övervinna dessa begränsningar utvecklades ett tillvägagångssätt för att bränna en floxerad embryonal dödlig gen av intresse för kortvariga kulturer av maligna perifera nervhöljestumörer (MPNST) som genereras i en GEM-modell.

Denna uppsats beskriver hur man etablerar en musmodell med lämplig genotyp, härleder kortvariga tumörkulturer från dessa djur och sedan ablaterar den floxerade embryonala dödliga genen med hjälp av en adenoviral vektor som uttrycker Cre-rekombinas och förbättrat grönt fluorescerande protein (eGFP). Rening av celler transducerade med adenovirus med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och kvantifieringen av de effekter som genablation utövar på cellulär proliferation, livskraft, transkriptom och ortotopisk allografttillväxt beskrivs sedan. Dessa metoder ger ett effektivt och generaliserbart tillvägagångssätt för att identifiera och validera terapeutiska mål in vitro och in vivo. Dessa tillvägagångssätt ger också en förnybar källa till tumörderiverade celler med låg passage med reducerade de vitro-tillväxtartefakter. Detta gör att den riktade genens biologiska roll kan studeras i olika biologiska processer såsom migration, invasion, metastasering och intercellulär kommunikation medierad av sekretomet.

Introduction

Före de senaste två decennierna förlitade sig behandlingen av mänskliga cancerformer starkt på strålbehandling och kemoterapeutiska medel som i stort sett riktade sig mot snabbt spridande cellulära populationer genom att skada DNA eller hämma DNA-syntesen. Även om dessa tillvägagångssätt hämmade cancercellstillväxt, hade de också skadliga biverkningar på normala snabbt spridande celltyper såsom tarmepitelceller och hårsäcksceller. På senare tid har cancerbehandling börjat använda kemoterapeutiska medel som exakt riktar sig mot proteiner inom signalvägar som är kritiskt viktiga för tillväxten av en enskild patients neoplasma. Detta tillvägagångssätt, vanligtvis kallat “Precision Medicine”, har lett till utvecklingen av en ständigt växande repertoar av monoklonala antikroppar och små molekylära hämmare. Dessa medel hämmar effektivt tumörcellsproliferation och överlevnad samtidigt som de skadliga biverkningarna på normala celltyper som ses med konventionella kemoterapeutiska medel och strålbehandling undviks. Monoklonala antikroppar som används för behandling av humana cancerformer riktar sig oftast mot cellytemolekyler såsom tillväxtfaktorreceptorer¹ (t.ex. den stora familjen av membranspännande receptortyrosinkinaser) och immunsvarsmodulatorer² (t.ex. programmerat celldödsprotein 1, programmerad dödsligand 1). Småmolekylära hämmare kan hämma antingen cellyteproteiner eller signalproteiner som ligger intracellulärt³. För att effektivt kunna använda dessa nya terapeutiska medel måste det dock fastställas att en viss cancer är beroende av den molekyl som riktas mot ett terapeutiskt kandidatmedel.

Även om dessa nya terapeutiska medel har mer fokuserade effekter, hämmar många av dem fortfarande verkan av mer än ett protein. Dessutom är flera medel med varierande effektivitet och specificitet ofta tillgängliga för att rikta in sig på ett specifikt protein. Under prekliniska undersökningar är det därför klokt att använda ytterligare metoder såsom genetisk ablation för att validera ett kandidatprotein som ett terapeutiskt mål. Ett särskilt användbart tillvägagångssätt för att validera ett protein som ett terapeutiskt mål är att ablatera genen som kodar för kandidatproteinet i en genetiskt konstruerad djurmodell som utvecklar den specifika cancertypen av intresse. Detta tillvägagångssätt kan vara relativt enkelt om möss med en nollmutation (antingen en naturlig mutation, en genetiskt konstruerad nollmutation [en “knockout”] eller en nollmutation introducerad av en genfälla) är tillgängliga och mössen är livskraftiga i vuxen ålder. Tyvärr är möss med en nollmutation som uppfyller dessa kriterier ofta inte tillgängliga, vanligtvis eftersom nollmutationen resulterar i död embryonalt eller under de första dagarna av postnatalt liv. Under denna omständighet kan möss som är benägna att utveckla tumörtypen av intresse istället korsas till möss där viktiga segment av genen av intresse flankeras av loxP-platser (“floxed”), vilket gör att genen kan brännas genom att införa en transgen som uttrycker Cre-rekombinas i tumörcellerna (en villkorlig knockout). Detta tillvägagångssätt ger flera fördelar. För det första, om en Cre-drivrutin är tillgänglig som uttrycks i tumören men inte i celltypen som ledde till döden i konventionella knockouts, kan detta tillvägagångssätt potentiellt validera det terapeutiska målet för kandidaten. För det andra, ablating av genen som kodar för kandidatproteinet i tumörceller men inte i andra intratumorala element såsom tumörassocierade fibroblaster eller immunceller gör det möjligt för utredaren att skilja mellan cellautonoma och icke-cellautonoma effekter av det terapeutiska målet. Slutligen tillåter en tamoxifeninducerbar Cre-drivrutin (CreER^T2) utredaren att radera genen av intresse i olika stadier i tumörutveckling och definiera det fönster där kandidaten terapeutiskt medel sannolikt kommer att vara effektivt.

Tyvärr finns det också tekniska problem som kan begränsa användningen av villkorliga knockouts i tumörer som uppstår i GEM-modeller. Till exempel kanske en Cre-drivrutin som uttrycks i tumörceller och undviker genradering i normala celler som är väsentliga för livet inte är tillgänglig. En annan fråga, som kan underskattas, är att Cre- och CreER^{T2-drivrutiner} ofta varierar floxerade alleler hos möss, vilket resulterar i mosaik för nollmutationen i en GEM-cancer. När detta inträffar kommer tumörceller där den riktade genen inte har bränts att fortsätta att sprida sig snabbt och överväxa tumörcellerna med bräkta alleler. Mosaicism i Cre-drivlinjer kan uppstå på grund av icke-allestädes närvarande Cre-uttryck i den riktade härstamningen och genom misslyckad rekombination i enskilda celler oberoende av Cre-uttryck⁴. Detta är ett känt fenomen av Cre-drivrutiner som är beroende av celltyp och bör beaktas vid experimentell design och datatolkning. Mosaicism kan maskera effekten av knockouten och leda till att en utredare felaktigt drar slutsatsen att genen av intresse inte är nödvändig för tumörcellsproliferation och / eller överlevnad och därmed inte är ett giltigt terapeutiskt mål.

Flera av dessa problem uppstod i en tidigare studie som försökte avgöra om receptortyrosinkinasen erbB4 var ett potentiellt terapeutiskt mål i MPNST-celler⁵. I dessa studier användes möss som uttrycker en transgen som kodar för neuregulin-1 (NRG1) isoform glialtillväxtfaktor-β3 (GGFβ3) under kontroll av Schwann-cellspecifika myelinprotein nollpromotor (P 0-GGFβ3-möss). P 0-GGFβ3-möss utvecklar flera plexiforma neurofibrom som utvecklas till att bli MPNST via en process som rekapitulerar processerna för neurofibrompatogenes och plexiform neurofibrom-MPNST-progression som ses hos patienter med det autosomala dominerande tumörkänslighetssyndromet neurofibromatos typ 1 (NF1)⁶. När den korsas till möss med en Trp53-nollmutation, den resulterande P 0-GGFβ3; Trp53^+/- möss utvecklar MPNST de novo som ses i cis-Nf1^+/-; Trp53^+/- möss.

Dessa MPNSTs rekapitulerar utvecklingen från Världshälsoorganisationens (WHO) grad II till WHO grad IV-lesioner som ses hos människor⁷. Hos P 0-GGFβ3-möss uppstår MPNST inom redan existerande plexiforma neurofibrom i trigeminusnerven (58%) och spinal dorsala nervrötter (68%)⁷; MPNST som uppstår i P 0-GGFβ3; Trp53^+/- möss har en mycket liknande fördelning. Hos människor uppstår MPNSTs oftast i ischiasnerven följt av brachial plexus, spinal nervrötter, vagus, femoral, median, sakral plexus, popliteal obturator och bakre tibial- och ulnarnerver⁸. Denna tumörfördelning i dessa GEM-modeller skiljer sig något från vad som ses hos människor. Emellertid de MPNSTs som uppstår i P 0-GGFβ3 och P_0-GGFβ3; Trp53 ^+/- möss är histologiskt identiska med humana MPNST, bär många av samma mutationer som ses hos humana MPNST och rekapitulerar processen för neurofibrom-MPNST-progression som ses hos NF1-patienter. Genereringen av P 0-GGFβ3 eller P_0-GGFβ3; Trp53^+/- möss som var Erbb4^-/- var inte genomförbara eftersom möss med två Erbb4 null-alleler dör i livmodern vid embryonal dag 10,5 sekundärt till hjärtfel⁹. Eftersom att rädda Erbb4-uttryck i hjärtat genom att införa en hjärtspecifik Erbb4-transgen (α-myosin tung kedja (MHC) –Erbb4) resulterar i livskraftiga Erbb4^-/- möss¹⁰, generationen möss med en komplicerad P 0-GGFβ3; Trp53^+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4^-/- genotyp försöktes.

Parningarna producerade emellertid inte möss i de förväntade mendeliska förhållandena, vilket indikerar att den önskade genotypen var skadlig. Därför genereringen av P 0-GGFβ3; Trp53^+/- möss med floxerade Erbb4-alleler ¹¹ och en CreER^T2-drivrutin försökte tillåta radering av Erbb4 i MPNST:erna som uppstod hos dessa möss. Hos dessa djur var många tumörceller med intakta Erbb4-alleler fortfarande närvarande (mosaicism). Den observerade mosaiken kan bero på ineffektiv tamoxifenleverans, vilket resulterade i skillnader i rekombinationseffektivitet i vävnaden. Möjligheten till spontana kompensationsmekanismer kan ytterligare bidra till mosaicism vid tamoxifenmedierad rekombination genom att kringgå kravet på Erbb4-uttryck. Det är möjligt att förlusten av Trp53 gör tumörceller mottagliga för ytterligare spontana “tillåtna” mutationer som kan förvirra tolkningen av data. Eftersom det verkade troligt att De Erbb4-intakta MPNST-cellerna skulle maskera konsekvenserna av att bränna Erbb4 i andra tumörceller, övergavs detta tillvägagångssätt.

Dessa hinder ledde till utvecklingen av en metod för att bränna Erbb4 i mycket tidiga passage MPNST-celler med hjälp av ett adenovirus som uttrycker Cre-rekombinas och eGFP. Dessa celler kan separeras från icke-infekterade celler med hjälp av FACS, vilket markant minskar mosaicismen för den brända Erbb4-genen . Nedan beskrivs de metoder som används för att uppnå detta, tillsammans med de metoder som används för att bedöma effekterna av genablation in vitro och in vivo. Följande protokoll är ett exempel på hur man producerar tumörbärande möss som ger tumörer som bär floxerade alleler av embryonala dödliga gener av intresse för ex vivo excision före in vivo allograft tumörtillväxtbedömning. Detta inkluderar en beskrivning av de metoder som används för att analysera effekten som Erbb4-ablation utövar på tumörcellsproliferation, överlevnad och genuttryck in vitro och proliferation, överlevnad och angiogenes i ortotopiska allografter.

Protocol

Innan du utför några procedurer med möss måste alla procedurer granskas och godkännas av institutional animal care and use committee. Protokollet som beskrivs i detta manuskript godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Medical University of South Carolina. Detta protokoll utfördes av korrekt utbildad personal enligt MUSC: s riktlinjer för institutionell djurvård. 1. Generation av möss som utvecklar MPNSTs homozygota för Erbb4 flox-alleler</e…

Representative Results

Figur 4 illustrerar ett typiskt resultat som erhålls vid generering av P 0-GGFβ3; Trp53-/+; Erbb4fl / fl MPNST-celler med antingen Ad5CMV-eGFP adenovirus eller Ad5CMV-Cre / eGFP adenovirus (Figur 4A). Kulturer ses med fluorescensmikroskopi för att identifiera eGFP-uttryckande celler och genom faskontrastmikroskopi för att bestämma det totala antalet celler som finns i samma fält vid 10x (överst) och 40x (…

Discussion

De detaljerade metoderna som presenteras här utvecklades med hjälp av en GEM-modell av MPNST: er. Men om tumörvävnaden av intresse kan spridas i enskilda celler, är dessa metoder lätt anpassningsbara för olika tumörtyper som uppstår i GEM. Det är viktigt att säkerställa att den floxerade allelen inte resulterar i i) minskad överlevnad som kan göra det svårt att få tillräckligt med möss för att screena för tumörer, eller ii) ökad tumörlatens som kan göra det svårt att få tillräckligt med tumörb…

Materials

Ad5CMV-eGFP	Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa	VVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFP	Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa	VVC-U of Iowa-1174
alexa 568 secondary antibody	Thermo/Fisher	GaR A11036
Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics	Bioconductor	http://www.bioconductor.org	alternative statistical analysis tool used for step 4.4
CD31	Abcam	ab28364
Celigo Image Cytometer	Nexcelom Bioscience	N/A
Cell Stripper	Corning	25-056-Cl	mixture of chelators
DAB staining kit	Vector Labs	MP-7800
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)	DAVID	https://david.ncifcrf.gov	functional enrichment analysis software used for step 4.5
DMEM	Corning	15-013-Cl
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)	Thermo/Fisher	EP0701 and K1072
erbB4 antibodies	Santa Cruz	sc-284
erbB4 antibodies	Abcam	ab35374
erbB4 antibodies	Millipore	HFR1: 05-1133
FACS Sorter	BD Biosciences	Aria II
Forskolin	Sigma	F6886
GenomeSpace Tools and Data Sources	GenomeSpace	https://genomespace.org/support/tools/	general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5
Glutamine	Corning	25-005-Cl
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool	Gorilla	N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il	functional enrichment analysis software used for step 4.5
GSEA Gene Set Enrichment Analysis	Broad Institute	N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp	functional enrichment analysis software used for step 4.5
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice	Envigo (Previously Harlan Labs)	69
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)	Illumina	Hi Seq 2500	DNA sequencer used for step 4.2
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis	DNAStar LaserGene software	N/A	software statistical and normalization analysis used for step 4.4
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly	software alignment used for step 4.3	N/A	software alignment used for step 4.3
Matrigel, low growth factor basement membrane matrix	Corning	354230
NRG1-beta	In house	Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF).
Nuclear Stain Hoeschst 33342	Thermo	62249
Panther Gene Ontology Classification System	Panther	http://pantherdb.org	functional enrichment analysis software used for step 4.5
Partek (BWA aligner and analyzer)	Partek, Ver 7	N/A	software alignment and statistical/normalization used for step 4.3
Pen/Strep	Corning	30-002-Cl
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA ACCCAG-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product.
Propidium Iodine	Fisher	51-351-0
Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays	R&D Systems	ARY003B
Real time glo	Promega	G9712	bioluminescent cell viability assay
ToppGene Suite	ToppGene	https://toppgene.cchmc.org	functional enrichment analysis software used for step 4.5
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)	Invitrogen	15596026
Tyramide Signal Amplification Kit	Perkin Elmer	NEL721001EA