Co-coltura di neuroni glutamatergici e cellule di glioma pediatrico di alto grado in dispositivi microfluidici per valutare le interazioni elettriche
Summary
Lavori recenti scoprono l’impatto neuronale sulle cellule di glioma pediatrico di alto grado (pHGG) e le loro interazioni reciproche. Il presente lavoro mostra lo sviluppo di un modello in vitro che co-coltiva cellule pHGG e neuroni glutamatergici e registra le loro interazioni elettrofisiologiche per imitare tali interattività.
Abstract
I gliomi pediatrici di alto grado (pHGG) rappresentano tumori cerebrali infantili e adolescenziali che portano una prognosi rapida e triste. Poiché è necessario superare la resistenza ai trattamenti attuali e trovare un nuovo modo di curare, è molto impegnativo modellare la malattia il più vicino possibile in un ambiente in vitro per testare nuovi farmaci e procedure terapeutiche. Studiare i loro processi patobiologici fondamentali, compresa l’ipereccitabilità dei neuroni glutammatergici, sarà un vero progresso nella comprensione delle interazioni tra il cervello ambientale e le cellule pHGG. Pertanto, per ricreare le interazioni neuroni/cellule pHGG, questo lavoro mostra lo sviluppo di un modello funzionale in vitro che co-coltiva i neuroni glutamatergici corticali derivati dall’uomo (hiPS) in cellule pHGG in dispositivi microfluidici compartimentati e un processo per registrare le loro modifiche elettrofisiologiche. Il primo passo è stato quello di differenziare e caratterizzare i neuroni glutamatergici umani. In secondo luogo, le cellule sono state coltivate in dispositivi microfluidici con linee cellulari derivate da pHGG. Il microambiente cerebrale e l’attività neuronale sono stati quindi inclusi in questo modello per analizzare l’impatto elettrico delle cellule pHGG su questi neuroni micro-ambientali. Le registrazioni elettrofisiologiche sono accoppiate utilizzando array multielettrodi (MEA) a questi dispositivi microfluidici per imitare le condizioni fisiologiche e registrare l’attività elettrica dell’intera rete neurale. Un aumento significativo dell’eccitabilità neuronale è stato sottolineato in presenza di cellule tumorali.
Introduction
I gliomi pediatrici di alto grado (pHGG) presentano un’estesa diversità genotipica e fenotipica a seconda dell’età del paziente, della posizione e dell’estensione anatomica del tumore e dei driver molecolari1. Sono tumori cerebrali aggressivi che sono scarsamente controllati con le opzioni di trattamento attualmente disponibili e sono la principale causa di morte correlata ai tumori cerebrali nei bambini e negli adolescenti2. Quindi, oltre l’80% dei pazienti recidiva entro 2 anni dalla diagnosi e la loro sopravvivenza mediana è di 9-15 mesi, a seconda delle posizioni cerebrali e delle mutazioni del conducente. L’assenza di trattamenti curativi è l’urgenza primaria per la ricerca di laboratorio ed evidenzia l’immediata necessità di nuovi approcci terapeutici innovativi. A tale scopo, sono state sviluppate linee cellulari derivate dal paziente (PDCL) con la speranza di fornire la diversità pHGG3 in linee bidimensionali (2D) e / o neurosfere tridimensionali (3D). Tuttavia, quelle colture cellulari in vitro derivate dal paziente non imitano tutte le situazioni variabili del cervello. Questi modelli non considerano gli ambienti neuro-anatomici macroscopici e microscopici tipicamente descritti in pHGG.
Di solito, il pHGG nei bambini più piccoli si sviluppa principalmente nelle regioni pontine e talamiche, mentre l’HGG adolescenziale e del giovane adulto si concentra nelle aree corticali, specialmente nei lobi frontotemporali1. Queste specificità di localizzazione in tutte le età pediatriche sembrano coinvolgere ambienti diversi che portano alla gliomagenesi e a una rete intricata tra le cellule tumorali e l’attività neuronale specifica4,5,6. Sebbene i meccanismi non siano ancora identificati, il pHGG si sviluppa principalmente da cellule precursori neurali lungo la traiettoria di differenziazione dei lignaggi astrogliali e oligodendrogliali. Mentre il ruolo di questi lignaggi gliali è stato a lungo limitato al semplice supporto strutturale per i neuroni, ora è chiaramente stabilito che si integrano interamente nei circuiti neurali e mostrano complesse interazioni bidirezionali gliale-neuronale in grado di riorganizzare le regioni strutturali del cervello e rimodellare i circuiti neuronali4,7,8 . Inoltre, l’aumento di brandelli di prove indica che il sistema nervoso centrale (SNC) svolge un ruolo critico nell’inizio e nella progressione del cancro al cervello. Lavori recenti si sono concentrati sull’attività neuronale, che sembra guidare la crescita e la mitosi delle neoplasie gliali attraverso fattori di crescita secreti e comunicazioni sinaptiche elettrochimiche dirette6,9. Reciprocamente, le cellule di glioma di alto grado sembrano influenzare la funzione neuronale con una crescente attività neuronale glutamatergica e modulare il funzionamento dei circuiti in cui sono strutturalmente ed elettricamente integrate9. Quindi, gli studi che utilizzano modelli derivati dal paziente e nuovi strumenti di neuroscienza che controllano l’azione dei neuroni hanno dimostrato un effetto specifico del circuito dell’attività neuronale sulla posizione, la crescita e la progressione del glioma. La maggior parte di queste proiezioni neuronali coinvolte nei gliomi sono glutamatergiche e comunicano attraverso le secrezioni di glutammato. Biomarcatori glutamatergici specifici come mGluR2 o vGlut1/2 sono comunemente descritti6.
È interessante notare che, nonostante la loro eterogeneità molecolare, i gliomi pediatrici e adulti di alto grado mostrano una tipica risposta proliferativa all’attività neuronale glutammatergica e ad altri fattori secreti come la neuroligina-3 o bdNF (fattore neurotrofico derivato dal cervello)4,6,10,11,12,13 . Nelle regioni corticali, gli HHG pediatrici e adulti possono indurre ipereccitabilità neuronale attraverso un aumento della secrezione di glutammato e inibire gli interneuroni GABA che portano a gliomi associati all’attività della rete epilettica14,15. Inoltre, i circuiti neurali possono essere rimodellati dai gliomi spingendo specifici compiti neurologici, ad esempio il linguaggio, e possono richiedere un’ulteriore attività neuronale organizzata9.
Sulla base di questo razionale, l’avanzamento della comprensione delle comunicazioni bidirezionali tra cellule di glioma e neuroni deve essere completamente chiarito e integrato con le prime fasi degli approcci pHGG in vitro. Tale modellazione innovativa è fondamentale per comprendere e misurare l’impatto dell’attività elettrica neuronale durante i test antidroga e anticipare la risposta pHGG nei circuiti cerebrali. I recenti sviluppi negli strumenti di neuroscienza, come i dispositivi microfluidici e i lavori di ricerca pHGG, sono il terreno per sviluppare nuovi approcci di modellazione ed essere ora in grado di integrare il microambiente cerebrale in modelli pHGG de vitro3,16,17,18,19. Accoppiati con registrazioni elettrofisiologiche che utilizzano array multielettrodi (MEA), i dispositivi microfluidici20,21,22 offrono la possibilità di imitare le condizioni fisiologiche registrando l’attività elettrica dell’intera rete neurale ed estrarre i parametri di connettività di rete in diverse condizioni. Questo dispositivo23,24 permette innanzitutto la deposizione precisa delle cellule in una camera direttamente su MEA. Questa tecnologia consente il controllo della densità e dell’omogeneità della semina cellulare su MEA e il controllo fine dello scambio di media, che è un passo fondamentale per la differenziazione del progenitore neurale umano direttamente nei dispositivi. Inoltre, l’attuale camera di deposizione può essere seminata con più cellule in diversi punti temporali.
Quindi, questo studio mirava a sviluppare un modello funzionale in vitro che co-coltivasse neuroni glutamatergici corticali derivati da stelo pluripotente umano (hiPS) e cellule derivate da pHGG in dispositivi microfluidici e registrasse la loro attività elettrica per valutare le interazioni elettriche tra entrambe le popolazioni cellulari. In primo luogo, i neuroni glutamatergici corticali derivati da hiPS sono stati ottenuti e caratterizzati in dispositivi microfluidici in diversi stadi di coltura [giorno 4 (D4), come cellule hiPS, e giorno 21 (D21) e giorno 23 (D23), come neuroni maturi glutamatergici]. Per la seconda fase della co-coltura, sono stati utilizzati due modelli di pHGG: linea UW479 pediatrica commercializzata e cellule pHGG avviate da un tumore del paziente (BT35)3, portatore di una mutazione driver H3.3 K27M. Infine, abbiamo eseguito registrazioni elettrofisiologiche di cellule glutamatergiche a D21 prima della semina delle cellule pHGG e D23 dopo 48 ore di co-coltura nello stesso dispositivo microfluidico. Le interazioni tra neuroni glutamatergici e cellule pHGG sono state caratterizzate da un aumento significativo dell’attività elettrofisiologica registrata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo lavoro descrive un accurato modello funzionale in vitro per valutare l’interazione tra neuroni glutamatergici corticali umani derivati da hiPS e cellule tumorali cerebrali in dispositivi microfluidici. Uno dei passaggi cruciali del presente protocollo è stata la differenziazione hiPS nei neuroni glutamatergici, che è stata confermata dalla diminuzione della colorazione immunofluorescente Nestin e Sox2 e dalla comparsa simultanea della colorazione mGluR2 e vGLUT1. Tuttavia, pochi progenitori neurali sono…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del programma Satt Conectus, Fondation de l’Université de Strasbourg, «J’ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «Franck, Rayon de Soleil» e «Semeurs d’Etoile». Ringraziamo i bambini e le famiglie colpite dagli HHG per il loro contributo a questa ricerca e il loro sostegno.
Materials
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
|
Cortical Glutamatergic Neurons
|
BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | – | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 – 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 – 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 – 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
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