글루타미터기뉴런과 소아 고학년 신경교세포의 공동 배양을 미세유체 장치로 결합하여 전기 적 상호 작용을 평가합니다.
Summary
최근 작품은 고급 소아 신경 교종에 신경 영향을 발견 (pHGG) 세포와 그들의 상호 작용. 본 작품은 생체 외 모델의 발달을 pHGG 세포와 글루타미터기뉴런과 기록하여 그 간 작용을 모방하였다.
Abstract
소아 고급 진모 (pHGG)는 급속한 음이없는 예후를 운반하는 유년기 및 사춘기 뇌암을 나타냅니다. 현재 치료에 대한 저항을 극복하고 새로운 치료법을 찾을 필요가 있기 때문에, 새로운 약물과 치료 절차를 테스트하기 위해 체외 설정에서 가능한 한 가까운 질병을 모델링하는 것은 매우 까다롭습니다. 글루타마테어기신경 과민성 을 포함한 그들의 근본적인 병리학 적 과정을 공부하는 것은 환경 두뇌와 pHGG 세포 사이 상호 작용을 이해하는 실제적인 진보가 될 것입니다. 따라서, 뉴런/pHGG 세포 상호 작용을 재현하기 위하여, 이 작품은 인간 유도한 다능성 줄기(hiPS)-유래 된 피질 글루타마테릭 뉴런 pHGG 세포를 구획화된 미세 유체 장치로 pHGG 세포와 그들의 전기생리학적 수정을 기록하는 프로세스를 공동 배양하는 시험관 내 모델의 발달을 보여줍니다. 첫 번째 단계는 인간의 글루타미터기 뉴런을 분화하고 특성화하는 것이었습니다. 둘째, 세포는 pHGG 유래 세포주를 가진 미세유체 장치에서 배양되었다. 뇌 미세 환경과 뉴런 활동은 이러한 마이크로 환경 뉴런에 pHGG 세포의 전기적 영향을 분석하기 위해 이 모델에 포함되었다. 전기 생리학적 기록은 이러한 미세 유체 장치에 다중 전기 분해 어레이(MEA)를 사용하여 생리적 조건을 모방하고 전체 신경망의 전기 활성을 기록합니다. 뉴런 흥분성에 있는 중요한 증가는 종양 세포의 존재에서 밑줄이 있었습니다.
Introduction
소아 고급 진모(pHGG)는 환자 연령, 종양 해부학적 위치 및 확장 및 분자 동인1에 따라 확장된 지노티픽 및 페노티픽 다이버시티를 나타낸다. 그(것)들은 현재 유효한 처리 선택권으로 제대로 통제되고 아이들과 청소년에 있는 두뇌 암과 관련되되되는 죽음의 주요한 원인인 공격적인 두뇌 종양입니다2. 따라서 환자의 80 % 이상이 진단 후 2 년 이내에 재발하고 있으며, 뇌 위치와 운전자 돌연변이에 따라 평균 생존율은 9-15 개월입니다. 치료 치료의 부재는 실험실 연구를위한 주요 충동이며 새로운 혁신적인 치료 접근 에 대한 즉각적인 필요성을 강조합니다. 이를 위해, 환자 유래 세포주(PDCL)는 2차원(2D) 라인 및/또는 3차원(3D) 신경구에서 pHGG 다이버시티3 를 제공한다는 희망으로 개발되었다. 그럼에도 불구 하 고, 그 환자 파생 된 체 외 세포 배양 모든 뇌 변수 상황을 모방 하지 않습니다. 이러한 모델은 일반적으로 pHGG에 기술된 거시적 및 현미경 신경 해부학 환경을 고려하지 않습니다.
일반적으로, 어린 아이들의 pHGG는 주로 pontine 및 thalamic 지역에서 발전하고 있는 반면, 사춘기와 젊은 성인의 HGG는 피질 지역에 집중하는 반면, 특히 정면 엽1에서. 소아 시대에 걸친 이러한 위치 특이성은 신경종과 종양 세포 와 특정 신경 활동 사이의 복잡한 네트워크로 이어지는 다른 환경을 수반하는 것으로 보입니다4,5,6. 메커니즘은 아직 확인되지 않지만, pHGG는 주로 천체 글리 올과 올리고 의 분화 궤적을 따라 신경 전구체 세포에서 개발. 이러한 신경교 혈통의 역할은 뉴런에 대한 간단한 구조적 지원에 오랫동안 제한되어 왔지만, 이제 는 신경 회로에 완전히 통합하고 뇌의 구조 영역을 재구성하고 뉴런 회로를 리모델링 할 수있는 복잡한 양방향 신경교신경 상호 작용을 나타낸다는 것이 명확합니다4,7,8 . 더욱이, 증거의 파쇄를 증가하는 것은 중추 신경계 (CNS)가 뇌암 개시 및 진행에 중요한 역할을한다는 것을 나타냅니다. 최근 의외의 성장 인자와 직접 전기화학적 시냅스 통신6,9을 통해 글리아 악성종양의 성장과 미토시스를 유도하는 것으로 보이는 신경 활동에 초점을 맞춘 최근 작품. 회귀적으로, 고급 신경교종 세포는 증가하는 글루타머지 뉴런 활동으로 신경 기능에 영향을 미치고 구조적으로 그리고 전기적으로 통합되는 회로의 작동을 조절하는 것처럼 보입니다9. 따라서, 환자 유래 모델과 뉴런 작용을 제어하는 새로운 신경 과학 도구를 사용하여 연구는 신경교종 위치, 성장 및 진행에 신경 활동의 회로 특정 효과를 입증했다. 교종에 관련 된 이러한 신경 투영의 대부분은 글루타머게틱 과 조미료 분비를 통해 의사 소통. mGluR2 또는 vGlut1/2와 같은 특정 글루타마테르기브 바이오마커는 일반적으로 설명되어 있습니다6.
흥미롭게도, 그들의 분자 이질성에도 불구하고, 소아및 성인 고학년 진모는 글루타민간 신경 활동 및 neuroligin-3 또는 BDNF (두뇌 유래 신경 영양인자)와 같은 그밖 분비한 요인에 전형적인 증식 반응을 보여줍니다 (두뇌 유래 신경 영양 인자)4,6,10,11,12,13 . 피질 영역에서, 소아 및 성인 HGGs 증가 된 조미료 분 비를 통해 신경 과민성을 유도 하 고 간 질 네트워크 활동과 관련 된 교감으로 이어지는 GABA 인터뉴런을 억제 할 수 있습니다14,15. 그 위에, 신경 회로는 특정 신경 학 작업을 추진 하는 gliomas에 의해 리모델링 될 수 있습니다., 예를 들어, 언어, 그리고 추가 조직 된 신경 활동을 요구할 수 있습니다9.
이 근거에 근거하여, 신경교종 세포와 신경 사이 양방향 커뮤니케이션의 이해를 전진하는 것은 완전히 해명되고 체외 pHGG 접근의 초기 단계와 통합되어야 합니다. 이러한 혁신적인 모델링은 약물 테스트 중 뉴런 전기 활동 영향을 이해하고 측정하고 뇌 회로에 pHGG 반응을 예측하는 데 매우 중요합니다. 미세 유체 장치 및 pHGG 연구 작품과 같은 신경 과학 도구의 최근 개발은 새로운 모델링 접근 법을 개발하고 이제 체외 pHGG 모델3,16,17,18,19에 뇌 미세 환경을 통합 할 수 있습니다. 다중 전기 극어(MEA)를 이용한 전기생리학적 기록과 결합된 미세유체 장치20,21,22는 전체 신경망의 전기 적 활성을 기록하고 여러 조건하에서 네트워크 연결 파라미터를 추출하면서 생리학적 조건을 모방할 수 있는 가능성을 제공한다. 이 장치23,24는 먼저 MEA에 직접 챔버에서 세포의 정확한 증착을 허용한다. 이 기술은 MEA에 세포 파종 밀도 및 균질성을 제어하고 인간 신경 전조자가 장치로 직접 분화하는 중요한 단계인 미디어 교환의 미세 한 제어를 가능하게합니다. 더욱이, 본 증착 챔버는 상이한 시점에서 다중 세포로 시드될 수 있다.
그래서, 이 연구는 인간 다능성 줄기 (hiPS)유래 된 피질 글루타마테기신경 및 pHGG 유래 세포를 미세 유체 장치로 공동 배양하고 두 세포 집단 사이의 전기 적 상호 작용을 평가하기 위해 전기 활동을 기록하는 기능적 인 시험관 내 모델을 개발하는 것을 목표로했습니다. 첫째, hiPS 유래 피질 글루타마테기닉 뉴런은 다양한 배양 단계[일 4일(D4), hiPS 세포로서, 21일(D21) 및 23일(D23) 및 23일(D23)에서 글루타머기틱 성숙뉴런으로 마이크로유체 장치에서 수득및 특징지어졌다. 공동 배양의 두 번째 단계를 위해, 두 개의 pHGG 모델이 사용되었다: 상용화 된 소아 UW479 라인과 pHGG 세포는 환자 종양에서 시작 (BT35)3, H3.3 K27M 드라이버 돌연변이를 베어링. 마지막으로, 동일한 미세 유체 장치에 공동 배양의 48 h 후 pHGG 세포 파종 및 D23 전에 D21에서 글루타미테르기 세포의 전기 생리학적 기록을 수행했습니다. 글루타미터기뉴런과 pHGG 세포 간의 상호작용은 기록된 전기생리활성의 현저한 증가를 특징으로 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 작품은 미세 유체 장치에서 인간 hiPS 파생 된 피질 글루타머기신경과 뇌 종양 세포 사이의 상호 작용을 평가하기 위해 정확한 기능적 인 체외 모델을 설명합니다. 본 프로토콜에서 중요한 단계 중 하나는 글루타머기 뉴런의 hiPS 분화였으며, 네스티닌과 Sox2 면역 형광염색 의 감소및 mGluR2 및 vGLUT1 염색의 동시 출현에 의해 확인되었다. 그럼에도 불구 하 고, 몇 가지 신경 선조 는 글루타머?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 Satt Conectus 프로그램, 퐁디 드 l’Université 드 스트라스부르, «J’ai 요구 라 루네», «Une 룰라드 부어 샬린», «LifePink», «프랭크, 레이온 드 솔레일»과 «셈퍼스 데토일»의 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 이 연구와 지원에 기여한 HG의 영향을 받는 어린이와 가족들에게 감사드립니다.
Materials
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
|
Cortical Glutamatergic Neurons
|
BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | – | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 – 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 – 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 – 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
References
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Ostrom, Q. T., et al. Alex’s lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro-Oncology. 16, 1-36 (2015).
- Blandin, A. F., et al. Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity. Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).
- Monje, M. Synaptic communication in brain cancer. Recherche en cancérologie. 80 (14), 2979-2982 (2020).
- Mount, C. W., Yalçın, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity. eLife. 18 (8), 49291 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders. Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Neftel, C., et al. An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Krishna, S., et al. Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival. BioRxiv. , (2021).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).
- Wang, X., et al. Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression. Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).
- Venkatesh, H. S., et al. Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma. Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).
- Venkatesh, H. S., et al. Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion. Cell. 161 (4), 803-816 (2015).
- Buckingham, S. C., et al. Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity. Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).
- Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks. Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).
- Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks. BioRxiv. , (2021).
- Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings. Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).
- Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks. Scientific Reports. 6, 28384 (2016).
- Nguyen, A., et al. Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1α axis inhibition. Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Cerea, A., et al. Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors. Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).
- Bruno, G., et al. Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Maisonneuve, B. G. C., et al. Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework. BioRxiv. , (2021).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Andreiuk, B., et al. Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo. Small. 13 (38), (2017).
