Glutamaterjik Nöronların ve Pediatrik Yüksek Dereceli Glioma Hücrelerinin Mikroakışkan Cihazlara Ortak Kültürü Elektriksel Etkileşimleri Değerlendirmek İçin
Summary
Son çalışmalar, yüksek dereceli pediatrik glioma (pHGG) hücreleri üzerindeki nöronal etkiyi ve bunların karşılıklı etkileşimlerini ortaya çıkarmaktadır. Bu çalışma, pHGG hücrelerini ve glutamaterjik nöronları birlikte kültleyen bir in vitro modelin gelişimini göstermektedir ve bu etkileşimleri taklit etmek için elektrofizyolojik etkileşimlerini kaydetmektedir.
Abstract
Pediatrik yüksek dereceli gliomalar (pHGG), hızlı bir dismal prognoz taşıyan çocukluk ve ergen beyin kanserlerini temsil eder. Mevcut tedavilere karşı direncin üstesinden gelmeye ve yeni bir tedavi yöntemi bulmaya ihtiyaç olduğundan, yeni ilaçları ve terapötik prosedürleri test etmek için in vitro bir ortamda hastalığı mümkün olduğunca yakın modellemek oldukça zorludur. Glutamaterjik nöron hiperexcitability de dahil olmak üzere temel patobiyolojik süreçlerini incelemek, çevresel beyin ve pHGG hücreleri arasındaki etkileşimleri anlamada gerçek bir ilerleme olacaktır. Bu nedenle, nöronları / pHGG hücre etkileşimlerini yeniden oluşturmak için, bu çalışma, insan kaynaklı Pluripotent Stem (hiPS) türevi kortikal glutamaterjik nöronlar pHGG hücrelerini bölümlere ayrılmış mikroakışkan cihazlara ve elektrofizyolojik modifikasyonlarını kaydetmek için bir süreç haline getirerek fonksiyonel bir in vitro modelin gelişimini göstermektedir. İlk adım, insan glutamaterjik nöronlarını ayırt etmek ve karakterize etmekti. İkinci olarak, hücreler pHGG türevi hücre hatlarına sahip mikroakışkan cihazlarda kültürlendi. Daha sonra pHGG hücrelerinin bu mikro çevresel nöronlar üzerindeki elektriksel etkisini analiz etmek için beyin mikroçevriciliği ve nöronal aktivitesi bu modele dahil edildi. Elektrofizyolojik kayıtlar, fizyolojik koşulları taklit etmek ve tüm sinir ağının elektriksel aktivitesini kaydetmek için bu mikroakışkan cihazlara multielektrod dizileri (MEA) kullanılarak birleştirilmiştir. Tümör hücrelerinin varlığında nöron ekssitability’de önemli bir artış olduğunun altı çizildi.
Introduction
Pediatrik yüksek dereceli gliomalar (pHGG), hasta yaşına, tümör anatomik konumuna ve uzantısına ve moleküler sürücülere bağlı olarak genişletilmiş genotipik ve fenotipik çeşitlilik sergiler1. Şu anda mevcut tedavi seçenekleri ile kötü kontrol edilen agresif beyin tümörleridir ve çocuk ve ergenlerde beyin kanserleri ile ilgili önde gelen ölüm nedenidir2. Yani, hastaların% 80’inden fazlası teşhislerinden sonraki 2 yıl içinde nüks ediyor ve beyin konumlarına ve sürücü mutasyonlarına bağlı olarak ortanca sağkalımları 9-15 aydır. İyileştirici tedavinin olmaması laboratuvar araştırmaları için birincil dürtüdür ve yeni yenilikçi terapötik yaklaşımlara olan acil ihtiyacı vurgulamaktadır. Bu amaçla, hasta kaynaklı hücre hatları (PDCL), pHGG çeşitliliğinin üç boyutlu (2D) çizgilerde ve/veya üç boyutlu (3D) nörosferlerde sağlanması umuduyla geliştirilmiştir. Bununla birlikte, hasta kaynaklı in vitro hücre kültürleri tüm beyin değişken durumlarını taklit etmez. Bu modeller tipik olarak pHGG’de tanımlanan makroskopik ve mikroskobik nöro-anatomik ortamları dikkate almaz.
Genellikle, küçük çocuklarda pHGG esas olarak pontin ve talamik bölgelerde gelişirken, ergen ve genç yetişkinin HGG’si kortikal alanlarda, özellikle frontotemporal loblarda yoğunlaşmak1. Pediatrik yaşlardaki bu konum özellikleri gliomageneze yol açan farklı ortamları ve tümör hücreleri ile spesifik nöronal aktivite arasında karmaşık bir ağı içeriyor gibi görünmektedir4,5,6. Mekanizmalar hala tanımlanmasa da, pHGG esas olarak astroglial ve oligodendroglial soyların farklılaşma yörüngesi boyunca sinirsel öncül hücrelerden gelişir. Bu glial soyların rolü uzun zamandır nöronlar için basit yapısal destekle sınırlı olsa da, artık tamamen sinir devrelerine entegre oldukları ve beynin yapısal bölgelerini yeniden düzenleyebilen ve nöronal devreleri yeniden şekillendirebilen karmaşık çift yönlü glial-nöronal etkileşimler sergiledikleri açıkça belirlenmiştir4,7,8 . Ayrıca, artan kanıt kırıntıları, merkezi sinir sisteminin (CNS) beyin kanserinin başlatılmasında ve ilerlemesinde kritik bir rol oynadığını göstermektedir. Son çalışmalar, salgılanan büyüme faktörleri ve doğrudan elektrokimyasal sinaptik iletişim yoluyla glial malignitelerin büyümesini ve mitozini yönlendiren nöronal aktiviteye odaklanmıştır6,9. Karşılıklı olarak, yüksek dereceli glioma hücreleri artan glutamaterjik nöronal aktivite ile nöronal fonksiyonu etkiliyor ve yapısal ve elektriksel olarak entegre oldukları devrelerin çalışmasını modüle ediyor gibi görünmektedir9. Bu nedenle, nöron eylemini kontrol eden hasta kaynaklı modeller ve yeni sinirbilim araçları kullanılarak yapılan çalışmalar, nöronal aktivitenin glioma konumu, büyümesi ve ilerlemesi üzerinde devreye özgü bir etkisini göstermiştir. Gliomalarda yer alan bu nöronal projeksiyonların çoğu glutamaterjiktir ve glutamat salgıları yoluyla iletişim kurar. mGluR2 veya vGlut1/2 gibi spesifik glutamaterjik biyobelirteçler yaygın olarak tanımlanır6.
İlginçtir ki, moleküler heterojenliklerine rağmen, pediatrik ve erişkin yüksek dereceli gliomalar glutamaterjik nöronal aktiviteye ve nöroligin-3 veya BDNF (beyin kaynaklı nörotrofik faktör) gibi diğer salgılanan faktörlere tipik bir proliferatif yanıt göstermektedir 4,6,10,11,12,13 . Kortikal bölgelerde pediatrik ve erişkin HGG’ler artan glutamat salgılanması yoluyla nöronal hiperexcitability’e neden olabilir ve epileptik ağ aktivitesi ile ilişkili gliomalara yol açan GABA internöronlarını inhibe edebilir14,15. Bunun da ayrıca, nöral devreler gliomalar tarafından belirli nörolojik görevleri, örneğin dili iterek yeniden şekillendirilebilir ve ek organize nöronal aktivite talep edebilir9.
Bu gerekçeye dayanarak, glioma hücreleri ve nöronlar arasındaki çift yönlü iletişimin anlaşılmasının ilerletilmesi, in vitro pHGG yaklaşımlarının erken aşamaları ile tam olarak aydınlatılmalı ve entegre edilmelidir. Bu tür yenilikçi modelleme, ilaç testi sırasında nöronal elektriksel aktivite etkisini anlama ve ölçmede ve beyin devrelerine pHGG yanıtını tahmin etmede çok önemlidir. Mikroakışkan cihazlar ve pHGG araştırma çalışmaları gibi nörobilim araçlarındaki son gelişmeler, yeni modelleme yaklaşımları geliştirmek ve artık beyin mikroçevrimini in vitro pHGG modellerine entegre edebilmek için yataktır3,16,17,18,19. Multielektrod dizileri (MEA) kullanan elektrofizyolojik kayıtlarla birleştiğinde, mikroakışkan cihazlar20,21,22, tüm sinir ağının elektriksel aktivitesini kaydederken fizyolojik koşulları taklit etme ve çeşitli koşullar altında ağ bağlantı parametrelerini çıkarma imkanı sunar. Bu cihaz23,24, önce hücrelerin doğrudan MEA’da bir odada hassas bir şekilde birikmesini sağlar. Bu teknoloji, MEA’daki hücre tohumlama yoğunluğunun ve homojenliğinin kontrolünü ve insan sinir progenitörlerinin doğrudan cihazlara farklılaşması için kritik bir adım olan medya değişiminin ince kontrolünü sağlar. Ayrıca, mevcut biriktirme odası farklı zaman noktalarında birden fazla hücre ile tohumlanabilir.
Bu nedenle, bu çalışma, insan Pluripotent Stem (hiPS) türevi kortikal glutamaterjik nöronları ve pHGG türevi hücreleri mikroakışkan cihazlara eş-kültleyen ve her iki hücre popülasyonu arasındaki elektriksel etkileşimleri değerlendirmek için elektriksel aktivitelerini kaydeden fonksiyonel bir in vitro model geliştirmeyi amaçlamıştır. İlk olarak, hiPS türevi kortikal glutamaterjik nöronlar, kültürün farklı aşamalarında mikroakışkan cihazlarda [gün 4 (D4), hiPS hücreleri olarak ve 21. Ortak kültürün ikinci adımı için iki pHGG modeli kullanıldı: H3.3 K27M sürücü mutasyonu taşıyan bir hasta tümöründen (BT35)3 başlatılan ticarileştirilmiş pediatrik UW479 hattı ve pHGG hücreleri. Son olarak, pHGG hücre tohumlamadan önce D21’de glutamaterjik hücrelerin elektrofizyolojik kayıtlarını ve aynı mikroakışkan cihaza 48 saat birlikte kültürden sonra D23’ü gerçekleştirdik. Glutamaterjik nöronlar ve pHGG hücreleri arasındaki etkileşimler, kaydedilen elektrofizyolojik aktivitede önemli bir artış ile karakterize edildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, mikroakışkan cihazlarda insan hiPS türevi kortikal glutamaterjik nöronlar ve beyin tümöral hücreleri arasındaki etkileşimi değerlendirmek için doğru bir fonksiyonel in vitro modeli açıklamaktadır. Mevcut protokoldeki önemli adımlardan biri, Nestin ve Sox2 immünofluoresan lekelenmenin azalması ve mGluR2 ve vGLUT1 lekelemenin eşzamanlı görünümü ile doğrulanan glutamaterjik nöronlardaki hiPS farklılaşmasıydı. Bununla birlikte, glutaterjik hücrelerin sadece yarısı het…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Satt Conectus programı, Fondation de l’Université de Strasbourg, «J’ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «Franck, Rayon de Soleil» ve «Semeurs d’Etoile» derneklerinin hibeleriyle desteklendi. HGG’lerden etkilenen çocuklara ve ailelere bu araştırmaya katkıları ve destekleri için teşekkür ederiz.
Materials
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
|
Cortical Glutamatergic Neurons
|
BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | – | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 – 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 – 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 – 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
References
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Ostrom, Q. T., et al. Alex’s lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro-Oncology. 16, 1-36 (2015).
- Blandin, A. F., et al. Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity. Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).
- Monje, M. Synaptic communication in brain cancer. Recherche en cancérologie. 80 (14), 2979-2982 (2020).
- Mount, C. W., Yalçın, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity. eLife. 18 (8), 49291 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders. Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Neftel, C., et al. An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Krishna, S., et al. Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival. BioRxiv. , (2021).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).
- Wang, X., et al. Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression. Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).
- Venkatesh, H. S., et al. Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma. Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).
- Venkatesh, H. S., et al. Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion. Cell. 161 (4), 803-816 (2015).
- Buckingham, S. C., et al. Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity. Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).
- Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks. Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).
- Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks. BioRxiv. , (2021).
- Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings. Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).
- Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks. Scientific Reports. 6, 28384 (2016).
- Nguyen, A., et al. Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1α axis inhibition. Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Cerea, A., et al. Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors. Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).
- Bruno, G., et al. Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Maisonneuve, B. G. C., et al. Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework. BioRxiv. , (2021).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Andreiuk, B., et al. Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo. Small. 13 (38), (2017).
