Udvikling af en Lateral Flow immunokromatisk strimmel til hurtig og kvantitativ påvisning af små molekyleforbindelser

Abstract

Membranbaserede sidestrøm immunkromatiske strimler (ICSs) er nyttige værktøjer til billig selvdiagnosticering og er blevet effektivt anvendt på toksin, fysiologisk indeks og klinisk biomarkørdetektering. I denne protokol giver vi en detaljeret beskrivelse af trinene til at udvikle en hurtig, følsom og kvantitativ lateral-flow immunoassay (ved hjælp af auNPs som markør og mAbs som sonde). Proceduren beskriver forberedelse og karakterisering af kolloidt guld, syntese af AuNP-mAb konjugat, samling af den immunokromatiske strimmel, og metodologisk undersøgelse af analysen. Resultaterne viste, at de sidste strimler kan udnyttes yderligere til hurtig og bekvem selvdiagnosticering af et lille molekyle, som kan give et alternativt værktøj i den hurtige og præcise analyse af fysiologiske og biologiske indekser.

Introduction

Membranbaserede sidestrøm immunokromatiske strimler (ICSs) er nyttige værktøjer til billig og hurtig detektion. Nitrocellulosemembranen som bærer og kolloidguld som markører for immunkromatografi rapid diagnostic reagenser er den mest almindeligt anvendte POCT (punkt for plejetest), og projektets testområde er bredere. Fra deres oprindelige anvendelse i overvågning under graviditeten er deres anvendelse blevet udvidet til at overvåge blodkoagulationstilstand^1,2, myokardieskade^3,veterinærmedicin⁴, pesticidrester^5,smitsomme sygdomme⁶ og lægemiddelkoncentrationer. Flere typer prøver kan vurderes, herunder urin, spyt, fuldblod, serum og andre kropsvæsker^7,8,9.

I de senere år er der udviklet talrige nye analyser til påvisning af biomarkører i diagnosticering af lidelser, herunder HPLC, UPLC, LC-MS og ELISA, som er følsomme og præcise, troværdige og specifikke. Disse metoder kræver dog sofistikeret instrumentering, kompleks forbehandling og tidskrævende behandlinger⁹. Derfor er det presserende^{10, 11}at udvikle en hurtigere og bekvem point-of-care diagnostisk strategi for selv- og realtidsdetektion af medicinske aktive forbindelser.

Populariteten af ICSs, især for almindelige tests, er drevet af deres brugervenlighed, da de ikke kræver fagfolk eller udarbejde instrumentale opsætninger¹². Med andre ord kan folk, der ikke har særlig træning, betjene strimler eller selvtest¹³. Resultaterne af testen kan opnås på 5 minutter, hvilket betyder, at den kan bruges til inspektioner på stedet¹⁴. Desuden kan omkostningerne ved strimler ifølge vores beregninger være lavere end 1 RMB¹⁵, hvilket betyder, at testene er billige til at fremme¹⁶. Derfor er ICS en relativt præcis, enkel og billig engangsenhed. ICSs baseret på kolloid guld^17,18 anvendes også i hurtig COVID-19 afsløring.

Princippet om ICS kan opdeles i sandwich ICS og konkurrencedygtige ICS. Figur 1A er et skematisk diagram over sandwich ICS, som hovedsageligt bruges til at opdage makromolekyllære stoffer som proteiner, herunder tumormarkører, inflammatoriske faktorer og human chorionic gonadotropin (HCG, tidlig graviditet antigen). I denne metode anvendes parrede antistoffer rettet mod forskellige epitoper af antigen, og opsamlingsantistoffet tørres på NC-membranen som en testlinje. Mærket antistof tørres på konjugatpuden, og sekundært antistof anvendes som kontrollinje.

Figur 1B er et skematisk diagram over konkurrencedygtige ICS, som hovedsageligt bruges til at detektere små molekylestoffer (MWCO < 2000 Da). Belægningsantigen er fastgjort på NC-membranen som en testlinje, og det mærkede antistof tørres på konjugatpuden. Under påvisning strømmer prøven og mærket antistof gennem detektionslinjen under kapillær handling, og det coatede antigen binder frit antigen i prøven og udvikler en rød farve på detektionslinjen.

For nylig beskrev vi proceduren for monoklonal antistofproduktion mod naturlige produkter¹⁹. I dette arbejde udviklede vi en ny lateral flow immunoassay baseret på den forberedte anti-SSD mA²⁰ til hurtig, on-site detektion. Resultaterne tyder på, at immunochromatografianalysen er et uundværligt og praktisk værktøj til påvisning af naturlige produktafledte forbindelser.

Figur 1 Skemat diagram over immunkromatografianalysen (A) Sandwich immunkromatiske teststrimler. (B) Indirekte konkurrencedygtige immunkromatografiske teststrimler. Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al., 2018²¹. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

Alle de procedurer, der blev udført i denne undersøgelse, blev godkendt af Ethics Review Committee på Beijing University of Chinese Medicine (godkendelsesnummer 2017BZYYL00120). 1. Forberedelse og karakterisering af kolloidt guld BEMÆRK: For kolloid guldsyntese, da kolloidguld let adsorberes på fartøjets indre væg og er tilbøjelig til at blive udfældet af urenheder, skal beholderen til syntese og opbevaring af kolloidguld rengøres grundigt o…

Representative Results

Karakterisering af kolloidt guldDe forberedte kolloide guldopløsninger var claret røde. TEM-analyser blev anvendt til at bestemme morfologien og formen af auNPs (figur 2A-D). Figur 2A og figur 2B viser, at partiklerne er polyhedrale i form og jævnt fordelt. Det blev konstateret, at auNPs’ gennemsnitlige diameter var ca. 14 nm (figur 2C). Et TEM -billede (High-Res…

Discussion

I dette arbejde præsenterer vi en protokol til fremstilling af mAbs mod naturlige produkt-afledte små molekyler. De væsentlige trin og de spørgsmål, der kræver opmærksomhed i proceduren, er blevet skitseret, og vi har vist nytten af denne protokol ved hjælp af det lille molekyle SSD som et eksempel. Eksempelspektre, TEM-billeder, kvantitative resultater og metodiske undersøgelser er vist i repræsentative data. Derfor har vi vist, at den kolloide guldproduktion, AuNP-mAb-bøjnings- og stripassemblystrategi, der …

Materials

Chloroauric acid solution (HAuCl4)	Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory	JY-SJ102
bovine serum albumin	AMRESCO	332
centrifuge tube 15 mL	Corning	430645
centrifuge tube 50 mL	Corning	430828
ELISA plates, 96 well	NUNC	655101
Filter paper	Sinopharm	H5072
Glass fibre membranes	Jieyi	XQ-Y6
goat-anti-mouse IgG antibody	applygen	C1308
Nitrocellulose membranes	Millipore	millipore 180
ovalbumin	Beijing BIODEE	5008-25g
PEG20000	Sigma Aldrich	RNBC6325
Pipette 10mL	COSTAR	4488
Pipette 25mL	FALCON	357525
semi-rigid PVC sheets	Jieyi	JY-C104
Sodium citrate	Beijing Chemical Works	C1034
sodium periodate	Sinopharm Chemical	BW-G0008
Sulfo-GMBS	Perbio Science Germany	22324
TipOne Tips 1,000 µL	Starlab	S1111-2021
Tris-HCl	Solarbio	77-86-1
TWEEN 20	Solarbio	9005-64-5