Sviluppo di una striscia immunocromatografica a flusso laterale per la rilevazione rapida e quantitativa di composti di piccole molecole
Abstract
Le strisce immunocromatografiche a flusso laterale a membrana (ICI) sono strumenti utili per l’autodiagnosi a basso costo e sono state applicate in modo efficiente alla rilevazione di tossine, indici fisiologici e biomarcatori clinici. In questo protocollo, forniamo una descrizione dettagliata dei passaggi per sviluppare un test immunologico a flusso laterale rapido, sensibile e quantitativo (utilizzando AuNP come marcatore e mAbs come sonda). La procedura descrive la preparazione e la caratterizzazione dell’oro colloidale, la sintesi del coniugato AuNP-mAb, l’assemblaggio della striscia immunocromatografica e l’indagine metodologica del saggio. I risultati hanno mostrato che le strisce finali possono essere ulteriormente utilizzate per l’autodiagnosi rapida e conveniente di una piccola molecola, che può fornire uno strumento alternativo nell’analisi rapida e precisa degli indici fisiologici e biologici.
Introduction
Le strisce immunocromatografiche a flusso laterale (ICI) a membrana sono strumenti utili per il rilevamento rapido e a basso costo. La membrana di nitrocellulosa come vettore e l’oro colloidale come marcatori dei reagenti diagnostici rapidi per cromatografia immunitaria sono il metodo POCT (point of care testing) più comunemente usato e l’ambito di prova del progetto è più ampio. Dalla loro applicazione originale nel monitoraggio durante la gravidanza, il loro uso è stato esteso per monitorare lo stato di coagulazione del sangue1,2, danno miocardico3, medicina veterinaria4, residui di pesticidi5, malattie infettive6 e concentrazioni di farmaci. È possibile valutare più tipi di campioni, tra cui urina, saliva, sangue intero, siero e altri fluidi corporei7,8,9.
Negli ultimi anni, sono stati sviluppati numerosi nuovi saggi per rilevare biomarcatori nella diagnosi di disturbi, tra cui HPLC, UPLC, LC-MS ed ELISA, che sono sensibili e accurati, credibili e specifici. Tuttavia, questi metodi richiedono strumentazione sofisticata, pre-elaborazione complessa e trattamenti dispendiosi in termini di tempo9. Quindi, lo sviluppo di una strategia diagnostica point-of-care più rapida e conveniente per il rilevamento autonomo e in tempo reale dei composti attivi medicinali è urgente10,11.
La popolarità degli I BIOS, soprattutto per i test comuni, è guidata dalla loro facilità d’uso, in quanto non richiedono professionisti o elaborate configurazioni strumentali12. In altre parole, le persone che non hanno una formazione speciale possono utilizzare strisce o auto-test13. I risultati del test possono essere ottenuti in 5 minuti, il che significa che può essere utilizzato per le ispezioni in loco14. Inoltre, secondo i nostri calcoli, il costo delle strisce potrebbe essere inferiore a 1 RMB15, il che significa che i test sono economici per promuovere16. Quindi, l’ICS è un dispositivo usa e getta relativamente accurato, semplice ed economico. Gli ISI basati sull’oro colloidale17,18 sono applicati anche nel rilevamento rapido covid-19.
Il principio di ICS può essere suddiviso in ICS sandwich e ICS competitivo. La Figura 1A è un diagramma schematico dell’ICS sandwich, che viene utilizzato principalmente per rilevare sostanze macromolecolari come le proteine, compresi i marcatori tumorali, i fattori infiammatori e la gonadotropina corionica umana (HCG, antigene della gravidanza precoce). In questo metodo, vengono utilizzati anticorpi accoppiati mirati a diversi epitopi dell’antigene e l’anticorpo di cattura viene essiccato sulla membrana NC come linea di prova. L’anticorpo etichettato viene essiccato sul tampone coniugato e l’anticorpo secondario viene utilizzato come linea di controllo.
La Figura 1B è un diagramma schematico dell’ICS competitivo, che viene utilizzato principalmente per rilevare sostanze a piccole molecole (MWCO < 2000 Da). L'antigene di rivestimento è fissato sulla membrana NC come linea di prova e l'anticorpo etichettato viene essiccato sul tampone coniugato. Durante il rilevamento, il campione e l'anticorpo marcato fluiscono attraverso la linea di rilevamento sotto azione capillare e l'antigene rivestito lega in modo competitivo l'antigene libero nel campione e sviluppa un colore rosso sulla linea di rilevamento.
Recentemente, abbiamo descritto la procedura di generazione di anticorpi monoclonali contro prodotti naturali19. In questo lavoro, abbiamo sviluppato un nuovo test immunologico a flusso laterale basato sull’anti-SSD mA20 preparato per un rilevamento rapido e in loco. I risultati indicano che il test immunocromatografico è uno strumento indispensabile e conveniente per rilevare composti naturali derivati dal prodotto.
Figura 1 Schema schematico del saggio immunocromatografico (A) Strisce reattive immunocromatografiche sandwich. (B) Strisce reattive immunocromatografiche competitive indirette. Questa cifra è stata modificata da Zhang et al., 201821. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo lavoro, presentiamo un protocollo per la preparazione di mAbs contro piccole molecole derivate da prodotti naturali. I passaggi essenziali e le questioni che richiedono attenzione nella procedura sono stati delineati e abbiamo dimostrato l’utilità di questo protocollo utilizzando l’SSD a piccola molecola come esempio. Spettri di esempio, immagini TEM, risultati quantitativi e indagini metodologiche sono mostrati in dati rappresentativi. Quindi, abbiamo dimostrato che la produzione di oro colloidale, la coniuga…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dai Fondi speciali per i fondi di ricerca fondamentale di istituti di istruzione superiore affiliati ai dipartimenti centrali. Apprezziamo il supporto del Classical Prescription Basic Research Team dell’Università di Medicina Cinese di Pechino.
Materials
| Chloroauric acid solution (HAuCl4) | Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory | JY-SJ102 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| Filter paper | Sinopharm | H5072 | |
| Glass fibre membranes | Jieyi | XQ-Y6 | |
| goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| Nitrocellulose membranes | Millipore | millipore 180 | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG20000 | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Pipette 10mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25mL | FALCON | 357525 | |
| semi-rigid PVC sheets | Jieyi | JY-C104 | |
| Sodium citrate | Beijing Chemical Works | C1034 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Tris-HCl | Solarbio | 77-86-1 | |
| TWEEN 20 | Solarbio | 9005-64-5 |
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