Utvikling av en lateral flow immunokromatografisk stripe for rask og kvantitativ påvisning av små molekylforbindelser
Abstract
Membranbaserte laterale strømningsimmunokromatografiske strimler (ICSer) er nyttige verktøy for rimelig selvdiagnose og har blitt effektivt brukt på toksin, fysiologisk indeks og klinisk biomarkørdeteksjon. I denne protokollen gir vi en detaljert beskrivelse av trinnene for å utvikle en rask, sensitiv og kvantitativ lateral-flow immunoassay (ved hjelp av AuNPs som markør og mAbs som sonde). Prosedyren beskriver fremstilling og karakterisering av kolloidalt gull, syntese av AuNP-mAb-konjugaten, montering av immunokromatografisk stripe og metodisk undersøkelse av analysen. Resultatene viste at de endelige strimlene kan brukes videre til rask og praktisk selvdiagnose av et lite molekyl, noe som kan gi et alternativt verktøy i den raske og presise analysen av fysiologiske og biologiske indekser.
Introduction
Membranbaserte laterale strømningsimmunokromatografiske strimler (ICSer) er nyttige verktøy for lavkostnads og rask deteksjon. Nitrocellulosemembranen som bærer og kolloidalt gull som markører for immunkromatografi hurtigdiagnostiske reagenser er den mest brukte POCT-metoden (point of care testing), og testomfanget av prosjektet er bredere. Fra deres opprinnelige anvendelse i overvåking under graviditet, har deres bruk blitt utvidet til å overvåke blodkoagulasjonstilstand1,2, hjerteinfarkt3, veterinærmedisin4, plantevernmidler rester5, smittsomme sykdommer6 og narkotikakonsentrasjoner. Flere typer prøver kan vurderes, inkludert urin, spytt, fullblod, serum og andre kroppsvæsker7,8,9.
De siste årene har det blitt utviklet en rekke nye analyser for å oppdage biomarkører i diagnostisering av lidelser, inkludert HPLC, UPLC, LC-MS og ELISA, som er følsomme og nøyaktige, troverdige og spesifikke. Disse metodene krever imidlertid sofistikert instrumentering, kompleks forbehandling og tidkrevende behandlinger9. Derfor er det presserende10,11å utvikle en raskere og mer praktisk diagnostisk strategi for selv- og sanntidsdeteksjon av medisinske aktive forbindelser .
Populariteten til ICSs, spesielt for vanlige tester, drives av brukervennlighet, da de ikke krever fagfolk eller forseggjorte instrumentale oppsett12. Med andre ord, folk som ikke har spesiell trening, kan betjene strimler eller selvtester13. Resultatene av testen kan oppnås på 5 minutter, noe som betyr at den kan brukes til stedsinspeksjoner14. Videre, ifølge våre beregninger, kostnaden for strimler kan være lavere enn 1 RMB15, noe som betyr at testene er billige å fremme16. Derfor er ICS en relativt nøyaktig, enkel og billig engangsenhet. ICSer basert på kolloidalt gull17,18 brukes også i rask COVID-19-deteksjon.
Prinsippet om ICS kan deles inn i sandwich ICS og konkurransedyktig ICS. Figur 1A er et skjematisk diagram over sandwich ICS, som hovedsakelig brukes til å oppdage makromolekylære stoffer som proteiner, inkludert tumormarkører, inflammatoriske faktorer og humant choriongonadotropin (HCG, tidlig graviditetsantigen). I denne metoden brukes parrede antistoffer rettet mot forskjellige epitoper av antigenet, og fangstantistoffet tørkes på NC-membranen som en testlinje. Merket antistoff tørkes på konjugatputen, og sekundært antistoff brukes som kontrollinjen.
Figur 1B er et skjematisk diagram over konkurransedyktig ICS, som hovedsakelig brukes til å oppdage små molekylstoffer (MWCO < 2000 Da). Beleggantigenet er festet på NC-membranen som en testlinje, og det merkede antistoffet tørkes på konjugatputen. Under deteksjon strømmer prøven og merket antistoff gjennom deteksjonslinjen under kapillær virkning, og det belagte antigenet binder konkurransedyktig fritt antigen i prøven og utvikler en rød farge på deteksjonslinjen.
Nylig beskrev vi prosedyren for monoklonal antistoffgenerering mot naturlige produkter19. I dette arbeidet utviklet vi en ny lateral flow immunoassay basert på den forberedte anti-SSD mA20 for rask deteksjon på stedet. Resultatene indikerer at immunokromatografianalysen er et uunnværlig og praktisk verktøy for å oppdage naturlige produktavledede forbindelser.
Figur 1 Skjematisk diagram over immunokromatografianalysen (A) Sandwich immunokromatografiske teststrimler. (B) Indirekte konkurransedyktige immunkromatografiske teststrimler. Denne figuren er endret fra Zhang et al., 201821. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette arbeidet presenterer vi en protokoll for fremstilling av mAbs mot naturlige produktavledede små molekyler. De viktigste trinnene og sakene som trenger oppmerksomhet i prosedyren er skissert, og vi har demonstrert nytten av denne protokollen ved hjelp av det lille molekylet SSD som eksempel. Eksempelspektra, TEM-bilder, kvantitative resultater og metodologiske undersøkelser vises i representative data. Derfor har vi demonstrert at den kolloidale gullproduksjonen, AuNP-mAb-konjugerings- og stripemonteringsstrateg…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Special Funds for Fundamental Research Funds of institutions of higher-learning tilknyttet sentrale avdelinger. Vi setter pris på støtten fra Classical Prescription Basic Research Team ved Beijing University of Chinese Medicine.
Materials
| Chloroauric acid solution (HAuCl4) | Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory | JY-SJ102 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| Filter paper | Sinopharm | H5072 | |
| Glass fibre membranes | Jieyi | XQ-Y6 | |
| goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| Nitrocellulose membranes | Millipore | millipore 180 | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG20000 | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Pipette 10mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25mL | FALCON | 357525 | |
| semi-rigid PVC sheets | Jieyi | JY-C104 | |
| Sodium citrate | Beijing Chemical Works | C1034 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Tris-HCl | Solarbio | 77-86-1 | |
| TWEEN 20 | Solarbio | 9005-64-5 |
References
- Huang, X., et al. Membrane-based lateral flow immunochromatographic strip with nanoparticles as reporters for detection: A review. Biosensors and Bioelectronics. 75, 166-180 (2016).
- Chang, H. -. F., Wang, J. -. Q., Wang, B., Deng, A. -. P. An immune chromatographic assay for rapid and simultaneous detection of levonorgestrel and methylprednisolone in water samples. Chinese Chemical Letters. 24 (10), 937-940 (2013).
- Lai, J. J., Stayton, P. S. Improving lateral-flow immunoassay (LFIA) diagnostics via biomarker enrichment for mHealth. Methods in Molecular Biology. 1256, 71-84 (2015).
- Zhang, M. Z., et al. Development of a colloidal gold-based lateral-flow immunoassay for the rapid simultaneous detection of clenbuterol and ractopamine in swine urine. Analytical & Bioanalytical Chemistry. 395 (8), 2591-2599 (2009).
- Kranthi, K. R., et al. Development of a colloidal-gold based lateral-flow immunoassay kit for ‘quality-control’ assessment of pyrethroid and endosulfan formulations in a novel single strip format. Crop Protection. 28 (5), 428-434 (2009).
- Qian, K., et al. Development and evaluation of an immunochromatographic strip for rapid detection of capsid protein antigen p27 of avian leukosis virus. Journal of Virological Methods. (221), 115-118 (2015).
- Guo, H., et al. Lateral flow immunoassay devices for testing saliva and other liquid samples and methods of use of same. US Patent. , (2003).
- Miočević, O., et al. Quantitative Lateral Flow Assays for Salivary Biomarker Assessment: A Review. Frontiers in Public Health. 5, 1-13 (2017).
- Lisa, M., et al. Gold nanoparticles based dipstick immunoassay for the rapid detection of dichlorodiphenyltrichloroethane: an organochlorine pesticide. Biosensors and Bioelectronics. 25 (1), 224-227 (2009).
- Zhang, Z., et al. Monoclonal Antibody-Europium Conjugate-Based Lateral Flow Time-Resolved Fluoroimmunoassay for Quantitative Determination of T-2 Toxin in Cereals and Feed. Analytical Methods. 7 (6), 2822-2829 (2015).
- Shen, H., et al. Facile synthesis of high-quality CuInZnxS2+x core/shell nanocrystals and their application for detection of C-reactive protein. Journal of Materials Chemistry. 22 (35), 18623-18630 (2012).
- Xiang, T., et al. A novel double antibody sandwich-lateral flow immunoassay for the rapid and simple detection of hepatitis C virus. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1041-1047 (2012).
- Yang, Q., et al. Quantum dot-based immunochromatography test strip for rapid, quantitative and sensitive detection of alpha fetoprotein. Biosensors & Bioelectronics. 30 (1), 145 (2011).
- Song, L. W., et al. Rapid fluorescent lateral-flow immunoassay for hepatitis B virus genotyping. Analytical Chemistry. 87, 5173-5180 (2015).
- Zhang, Y., et al. Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).
- Qu, H., et al. Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of GsRerarin. Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
- Li, Z., et al. Development and Clinical Application of a Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis. Journal of Medical Virology. 92 (9), (2020).
- Xiaomei, L., Jing, W., Ya, Z. The clinical application value analysis of the 2019-coronary virus disease was analyzed by the whole blood Sars-COV 2 specific antibody detection. Natural Science Edition. 42, (2020).
- Zhang, Y., et al. Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products. Journal of Visualized Experiments. , e57116 (2019).
- Sai, J., et al. Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Immunoaffinity Column Chromatography for Saikosaponin d Using an Anti-Saikosaponin d Monoclonal Antibody. Planta Medica. 82, 432-439 (2016).
- Yue, Z., et al. A Highly Sensitive Immunochromatographic Strip Test for Rapid and Quantitative Detection of Saikosaponin d. Molecules. 23 (2), 338 (2018).
- Qu, H., et al. Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of Puerarin. Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
- Zhang, Y., et al. Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).
