Imagem intravital longitudinal através de janelas de silicone claras
Summary
Uma abordagem é aqui apresentada para imagens intravitais de longo prazo usando janelas de silicone opticamente claras que podem ser coladas diretamente ao tecido/órgão de interesse e à pele. Essas janelas são mais baratas e mais versáteis do que outras atualmente utilizadas no campo, e a inserção cirúrgica causa inflamação e angústia limitadas aos animais.
Abstract
A microscopia intravital (IVM) permite a visualização do movimento celular, divisão e morte na resolução unicelular. O IVM através de janelas de imagem cirurgicamente inseridas é particularmente poderoso porque permite a observação longitudinal do mesmo tecido durante dias a semanas. Janelas de imagem típicas compreendem uma mancha de vidro em uma estrutura metálica biocompatível suturada na pele do rato. Essas janelas podem interferir com a livre circulação dos camundongos, provocar uma forte resposta inflamatória e falhar devido a vidros quebrados ou suturas rasgadas, qualquer uma das quais pode exigir eutanásia. Para resolver essas questões, janelas para imagem de órgão abdominal de longo prazo e gland mamária foram desenvolvidas a partir de uma película fina de polidimtilsiloxano (PDMS), um polímero de silicone opticamente claro anteriormente usado para janelas de imagem craniana. Essas janelas podem ser coladas diretamente nos tecidos, reduzindo o tempo necessário para a inserção. O PDMS é flexível, contribuindo para sua durabilidade em camundongos ao longo do tempo — até 35 dias foram testados. A imagem longitudinal é a imagem da mesma região tecidual durante sessões separadas. Uma rede de aço inoxidável foi incorporada dentro das janelas para localização da mesma região, permitindo a visualização de processos dinâmicos (como a involução da glândula mamária) nos mesmos locais, com dias de diferença. Esta janela de silicone também permitiu o monitoramento de células cancerígenas únicas disseminadas que se desenvolvem em micro-metástases ao longo do tempo. As janelas de silicone utilizadas neste estudo são mais simples de inserir do que janelas de vidro emolduradas em metal e causam inflamação limitada dos tecidos imaged. Além disso, as grades incorporadas permitem o rastreamento direto da mesma região tecidual em sessões de imagem repetidas.
Introduction
A microscopia intravital (IVM), a imagem de tecidos em animais anestesiados, oferece insights sobre a dinâmica dos eventos fisiológicos e patológicos na resolução celular em tecidos intactos. As aplicações dessa técnica variam bastante, mas o IVM tem sido fundamental no campo da biologia do câncer para ajudar a elucidar como as células cancerígenas invadem tecidos e metástases, interagem com o microambiente circundante e respondem a medicamentos 1,2,3. Além disso, o IVM tem sido fundamental para avançar na compreensão dos mecanismos complexos que regem as respostas imunológicas, fornecendo insights complementares às abordagens de perfil ex vivo (por exemplo, citometria de fluxo). Por exemplo, experimentos de imagem intravital revelaram detalhes sobre funções imunológicas no que se referem à migração celular e contato celular e ofereceram uma plataforma para quantificar a dinâmica espacial em resposta a lesões ou infecções 4,5,6,7. Muitos desses processos também podem ser estudados através de coloração histológica, mas apenas o IVM permite o rastreamento de mudanças dinâmicas. De fato, enquanto uma seção histológica oferece um instantâneo do tecido em um dado momento, a imagem intravital pode rastrear eventos intercelulares e subcelulares dentro do mesmo tecido ao longo do tempo. Em particular, o progresso na rotulagem de fluorescência e o desenvolvimento de repórteres moleculares permitiram que eventos moleculares se correlacionam com comportamentos celulares, como proliferação, morte, motilidade e interação com outras células ou a matriz extracelular. A maioria das técnicas de IVM são baseadas na microscopia de fluorescência, que devido à dispersão de luz, torna a imagem mais profunda desafiadora. O tecido de interesse, portanto, muitas vezes precisa ser exposto cirurgicamente com um procedimento muitas vezes invasivo e terminal. Assim, dependendo do local do órgão, o tecido pode ser imagedo continuamente por um período variando de poucos a 40 h8. Alternativamente, a inserção cirúrgica de uma janela permanente de imagem permite a imagem do mesmo tecido sequencialmente durante um período de dias até semanas 7,9.
O desenvolvimento de novas janelas de imagem tem sido destacado como uma necessidade tecnológica para melhorar ainda mais as abordagens de imagem intravital10. A janela de imagem intravital prototípica é um anel de metal contendo uma mancha de vidro presa à pele com suturas11. Interferências com a livre circulação, o acúmulo de exsudato e danos à tampa de vidro são problemas comuns vistos com o uso dessas janelas. Além disso, a janela prototípica requer produção especializada, e o procedimento cirúrgico pode exigir treinamento extensivo. Para resolver essas questões, o polidimtilsiloxano (PDMS), um polímero de silicone, que já foi usado em janelas cranianas para imagens de longo prazo no cérebro12, foi adaptado para uso em imagens de órgãos abdominais e glândulas mamárias. Aqui, é apresentado um método detalhado para a geração de janelas de silicone baseadas em PDMS, incluindo como lançar a janela em torno de uma grade de aço inoxidável para fornecer marcos para imagens repetidas das mesmas regiões teciduais. Além disso, é descrito um procedimento cirúrgico simples e sem pontos para inserir a janela sobre órgãos abdominais ou a glândula mamária. Esta nova abordagem supera alguns dos problemas mais comuns com janelas de imagem usadas atualmente e aumenta a acessibilidade de imagens intravitais longitudinais.
Protocol
Representative Results
Discussion
As janelas de imagem intravital são ferramentas importantes para visualizar diretamente processos fisiológicos e patológicos na resolução celular à medida que se desdobram ao longo do tempo. O novo procedimento descrito para fundir e inserir janelas flexíveis de imagem de silicone em camundongos supera alguns dos problemas mais comuns com janelas de imagem usadas atualmente (exsudate, quebra e interferência com a mobilidade normal), proporciona segurança adicional para o rato e aumenta a acessibilidade desta té…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Rob Eifert por sua ajuda na concepção e otimização das grades de aço inoxidável cortadas a laser. Este trabalho foi apoiado pelo Centro de Câncer da CSHL (P30-CA045508) e fundos para m.E. dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) (1R01CA2374135 e 5P01CA013106-49); CSHL e Northwell Health; a Fundação Família Thompson; Nade através da América; e uma bolsa da Fundação Simons para a CSHL. O M.S. foi apoiado pelo National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) e pelo National Cancer Institute of the NIH sob o prêmio número 1F30CA253993-01. L.M. é apoiado por uma Bolsa de Pós-Doutorado da Fundação James S. McDonnell. J.M.A. é o beneficiário de uma Bolsa de Pós-Doutorado do Instituto de Pesquisa do Câncer/Irvington (Prêmio CRI #3435). O D.A.T. é apoiado pelo Laboratório Dedicado da Fundação Lustgarten para Pesquisa de Câncer Pancreático e pela Thompson Family Foundation. Desenhos animados foram criados com Biorender.com.
Materials
| 3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape | 3M | 70200770819 | |
| Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | N267H | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 22974 | |
| AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products Co. | ||
| Acqknowledge software and sensors | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Antibody | Abcam | ab125212 | |
| Curity gauze sponges | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Two-part, 10:1 mixing ratio |
| Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro 3D printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Far Infrared Heated blanket | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Receptor Blocker | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Fiji imaging processing package | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Gating system: | BIOPAC Systems Inc. | The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems. | |
| Acqknowledge software | ACK100W, ACK100M | ||
| Diff. Amp. Module, C Series | DA100C | ||
| Dual Gating Sys small animal | DTU200 | ||
| MP160 for Windows – Analysis system | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V;015000 | ||
| Pressure Pad | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Absorbable gelatin sponge |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody | R&D Systems | AF3667 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP mice | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | Servohydraulic material testing machine | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST probe | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. | ||
| Polylactic acid filament | Hatchbox | 1.75 mm diameter | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 wound clips | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Stainless steel grid | Fotofab | One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square. | |
| Surface Treated SterileTissue Culture Plates | Fisher Scientific | FB012929 | Lid used as curing surface for imaging windows |
| TriM Scope Multiphoton Microscope | LaVision BioTec | Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr |
|
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48404-453 |
References
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