Longitudinale intravitale beeldvorming door heldere siliconenvensters
Summary
Hier wordt een benadering gepresenteerd voor intravitale beeldvorming op lange termijn met behulp van optisch heldere, siliconen vensters die rechtstreeks op het weefsel / orgaan van belang en de huid kunnen worden gelijmd. Deze ramen zijn goedkoper en veelzijdiger dan andere die momenteel in het veld worden gebruikt, en de chirurgische inbrenging veroorzaakt beperkte ontsteking en leed voor de dieren.
Abstract
Intravitale microscopie (IVM) maakt visualisatie van celbeweging, deling en dood mogelijk bij eencellige resolutie. IVM via chirurgisch ingebrachte beeldvormingsvensters is bijzonder krachtig omdat het longitudinale observatie van hetzelfde weefsel gedurende dagen tot weken mogelijk maakt. Typische beeldvormingsvensters bestaan uit een glazen afdekplaat in een biocompatibel metalen frame dat aan de huid van de muis is gehecht. Deze vensters kunnen de vrije beweging van de muizen verstoren, een sterke ontstekingsreactie uitlokken en falen als gevolg van gebroken glas of gescheurde hechtingen, die allemaal euthanasie kunnen vereisen. Om deze problemen aan te pakken, werden vensters voor beeldvorming van buikorganen en borstklieren op lange termijn ontwikkeld uit een dunne film van polydimethylsiloxaan (PDMS), een optisch helder siliconenpolymeer dat eerder werd gebruikt voor craniale beeldvormingsvensters. Deze vensters kunnen rechtstreeks op de weefsels worden gelijmd, waardoor de tijd die nodig is voor het inbrengen wordt verkort. PDMS is flexibel en draagt bij aan de duurzaamheid bij muizen in de loop van de tijd – tot 35 dagen zijn getest. Longitudinale beeldvorming is beeldvorming van hetzelfde weefselgebied tijdens afzonderlijke sessies. Een roestvrijstalen rooster werd ingebed in de ramen om hetzelfde gebied te lokaliseren, waardoor dynamische processen (zoals involutie van de melkklier) op dezelfde locaties, dagen na elkaar, konden worden gevisualiseerd. Dit siliconenvenster maakte het ook mogelijk om afzonderlijke verspreide kankercellen te volgen die zich in de loop van de tijd ontwikkelen tot micrometastasen. De siliconen ramen die in deze studie worden gebruikt, zijn eenvoudiger in te brengen dan glazen ramen met een metalen frame en veroorzaken een beperkte ontsteking van de afgebeelde weefsels. Bovendien maken ingebedde rasters het mogelijk om hetzelfde weefselgebied eenvoudig te volgen in herhaalde beeldvormingssessies.
Introduction
Intravitale microscopie (IVM), de beeldvorming van weefsels bij verdoofde dieren, biedt inzicht in de dynamiek van fysiologische en pathologische gebeurtenissen bij cellulaire resolutie in intacte weefsels. De toepassingen van deze techniek variëren sterk, maar IVM heeft een belangrijke rol gespeeld op het gebied van kankerbiologie om te helpen ophelderen hoe kankercellen weefsels binnendringen en uitzaaien, interageren met de omliggende micro-omgeving en reageren op geneesmiddelen 1,2,3. Bovendien is IVM de sleutel geweest tot het bevorderen van het begrip van de complexe mechanismen die immuunresponsen beheersen door inzichten te bieden die complementair zijn aan ex vivo profileringsbenaderingen (bijv. Flowcytometrie). Intravitale beeldvormingsexperimenten hebben bijvoorbeeld details onthuld over immuunfuncties als ze betrekking hebben op celmigratie en cel-celcontact en hebben een platform geboden om spatiotemporale dynamica te kwantificeren als reactie op letsel of infectie 4,5,6,7. Veel van deze processen kunnen ook worden bestudeerd door histologische kleuring, maar alleen IVM maakt het mogelijk om dynamische veranderingen te volgen. In feite, terwijl een histologische sectie een momentopname van het weefsel op een bepaald moment biedt, kan intravitale beeldvorming intercellulaire en subcellulaire gebeurtenissen in hetzelfde weefsel in de loop van de tijd volgen. Met name de vooruitgang in fluorescentielabeling en de ontwikkeling van moleculaire reporters hebben het mogelijk gemaakt moleculaire gebeurtenissen te correleren met cellulair gedrag, zoals proliferatie, dood, beweeglijkheid en interactie met andere cellen of de extracellulaire matrix. De meeste IVM-technieken zijn gebaseerd op fluorescentiemicroscopie, wat vanwege lichtverstrooiing het afbeelden van diepere weefsels een uitdaging maakt. Het weefsel van belang moet daarom vaak chirurgisch worden blootgesteld met een vaak invasieve en terminale procedure. Afhankelijk van de plaats van het orgaan kan het weefsel dus continu worden afgebeeld gedurende een periode variërend van enkele tot 40 h8. Als alternatief maakt het chirurgisch inbrengen van een permanent beeldvormingsvenster de beeldvorming van hetzelfde weefsel sequentieel mogelijk gedurende een periode van dagen tot week 7,9.
De ontwikkeling van nieuwe beeldvormingsvensters is benadrukt als een technologische noodzaak om intravitale beeldvormingsbenaderingen verder te verbeteren10. Het prototypische intravitale beeldvormingsvenster is een metalen ring met een glazen dekplaat die met hechtingen aan de huid is bevestigd11. Interferentie met vrije beweging, de accumulatie van exsudaat en schade aan de glazen afdekkingslip zijn veel voorkomende problemen bij het gebruik van dergelijke ramen. Bovendien vereist het prototypische venster gespecialiseerde productie en kan de chirurgische procedure uitgebreide training vereisen. Om deze problemen aan te pakken, werd polydimethylsiloxaan (PDMS), een siliconenpolymeer, dat eerder is gebruikt in schedelvensters voor langetermijnbeeldvorming in de hersenen12, aangepast voor gebruik in beeldvorming van buikorganen en borstklieren. Hier wordt een gedetailleerde methode gepresenteerd voor het genereren van op PDMS gebaseerde siliconenvensters, inclusief hoe het venster rond een roestvrijstalen raster kan worden gegoten om oriëntatiepunten te bieden voor herhaalde beeldvorming van dezelfde weefselgebieden. Verder wordt een eenvoudige, steekvrije chirurgische ingreep beschreven voor het inbrengen van het venster boven buikorganen of de borstklier. Deze nieuwe aanpak overwint enkele van de meest voorkomende problemen met momenteel gebruikte beeldvormingsvensters en verhoogt de toegankelijkheid van longitudinale intravitale beeldvorming.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intravitale beeldvormingsvensters zijn belangrijke hulpmiddelen voor het direct visualiseren van fysiologische en pathologische processen met cellulaire resolutie terwijl ze zich in de loop van de tijd ontvouwen. De nieuwe procedure die wordt beschreven voor het gieten en invoegen van flexibele, siliconenbeeldvormingsvensters bij muizen overwint enkele van de meest voorkomende problemen met momenteel gebruikte afbeeldingsvensters (exsudaat, breken en interferentie met normale mobiliteit), biedt extra veiligheid voor de m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Rob Eifert voor zijn hulp bij het ontwerpen en optimaliseren van de lasergesneden rvs roosters. Dit werk werd ondersteund door het CSHL Cancer Center (P30-CA045508) en fondsen voor ME van de National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 en 5P01CA013106-49); CSHL en Northwell Health; de Thompson Family Foundation; Zwem door Amerika; en een subsidie van de Simons Foundation aan CSHL. MS werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) en het National Cancer Institute van de NIH onder toekenningsnummer 1F30CA253993-01. L.M. wordt ondersteund door een James S. McDonnell Foundation Postdoctoral Fellowship. J.M.A. is de ontvanger van een Cancer Research Institute/Irvington Postdoctoral Fellowship (CRI Award #3435). D.A.T. wordt ondersteund door de Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research en de Thompson Family Foundation. Cartoons werden gemaakt met Biorender.com.
Materials
| 3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape | 3M | 70200770819 | |
| Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | N267H | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 22974 | |
| AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products Co. | ||
| Acqknowledge software and sensors | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Antibody | Abcam | ab125212 | |
| Curity gauze sponges | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Two-part, 10:1 mixing ratio |
| Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro 3D printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Far Infrared Heated blanket | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Receptor Blocker | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Fiji imaging processing package | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Gating system: | BIOPAC Systems Inc. | The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems. | |
| Acqknowledge software | ACK100W, ACK100M | ||
| Diff. Amp. Module, C Series | DA100C | ||
| Dual Gating Sys small animal | DTU200 | ||
| MP160 for Windows – Analysis system | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V;015000 | ||
| Pressure Pad | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Absorbable gelatin sponge |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody | R&D Systems | AF3667 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP mice | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | Servohydraulic material testing machine | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST probe | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. | ||
| Polylactic acid filament | Hatchbox | 1.75 mm diameter | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 wound clips | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Stainless steel grid | Fotofab | One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square. | |
| Surface Treated SterileTissue Culture Plates | Fisher Scientific | FB012929 | Lid used as curing surface for imaging windows |
| TriM Scope Multiphoton Microscope | LaVision BioTec | Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr |
|
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48404-453 |
References
- Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
- Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
- Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
- Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
- Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917 (2014).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
- Anderson, T. L. . Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).
- Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
