Imagerie intravitale longitudinale à travers des fenêtres en silicone transparent
Summary
Une approche est présentée ici pour l’imagerie intravitale à long terme utilisant des fenêtres en silicone optiquement claires qui peuvent être collées directement sur le tissu / organe d’intérêt et la peau. Ces fenêtres sont moins chères et plus polyvalentes que d’autres actuellement utilisées sur le terrain, et l’insertion chirurgicale provoque une inflammation et une détresse limitées chez les animaux.
Abstract
La microscopie intravitale (MIV) permet de visualiser le mouvement, la division et la mort des cellules à une résolution unicellulaire. La MIV à travers des fenêtres d’imagerie insérées chirurgicalement est particulièrement puissante car elle permet l’observation longitudinale du même tissu sur des jours ou des semaines. Les fenêtres d’imagerie typiques comprennent un couvercle en verre dans un cadre métallique biocompatible suturé à la peau de la souris. Ces fenêtres peuvent interférer avec la libre circulation des souris, provoquer une forte réponse inflammatoire et échouer en raison de bris de verre ou de sutures déchirées, dont l’une peut nécessiter une euthanasie. Pour résoudre ces problèmes, des fenêtres pour l’imagerie à long terme des organes abdominaux et des glandes mammaires ont été développées à partir d’un film mince de polydiméthylsiloxane (PDMS), un polymère de silicone optiquement clair précédemment utilisé pour les fenêtres d’imagerie crânienne. Ces fenêtres peuvent être collées directement sur les tissus, ce qui réduit le temps nécessaire à l’insertion. Le PDMS est flexible, contribuant à sa durabilité chez la souris au fil du temps – jusqu’à 35 jours ont été testés. L’imagerie longitudinale est l’imagerie de la même région tissulaire au cours de séances distinctes. Une grille en acier inoxydable a été intégrée dans les fenêtres pour localiser la même région, permettant la visualisation de processus dynamiques (comme l’involution des glandes mammaires) aux mêmes endroits, à quelques jours d’intervalle. Cette fenêtre en silicone a également permis de surveiller les cellules cancéreuses disséminées uniques se développant en micro-métastases au fil du temps. Les fenêtres en silicone utilisées dans cette étude sont plus simples à insérer que les fenêtres en verre à cadre métallique et provoquent une inflammation limitée des tissus imagés. De plus, les grilles intégrées permettent un suivi simple de la même région tissulaire lors de séances d’imagerie répétées.
Introduction
La microscopie intravitale (MIV), l’imagerie des tissus chez les animaux anesthésiés, offre un aperçu de la dynamique des événements physiologiques et pathologiques à la résolution cellulaire dans les tissus intacts. Les applications de cette technique varient considérablement, mais la MIV a joué un rôle déterminant dans le domaine de la biologie du cancer pour aider à élucider comment les cellules cancéreuses envahissent les tissus et métastasent, interagissent avec le microenvironnement environnant et répondent aux médicaments 1,2,3. En outre, la MIV a joué un rôle clé dans la compréhension des mécanismes complexes régissant les réponses immunitaires en fournissant des informations complémentaires aux approches de profilage ex vivo (par exemple, cytométrie en flux). Par exemple, des expériences d’imagerie intravitale ont révélé des détails sur les fonctions immunitaires en ce qui concerne la migration cellulaire et le contact cellule-cellule et ont offert une plate-forme pour quantifier la dynamique spatio-temporelle en réponse à une blessure ou à une infection 4,5,6,7. Beaucoup de ces processus peuvent également être étudiés par coloration histologique, mais seule la MIV permet le suivi des changements dynamiques. En fait, alors qu’une section histologique offre un instantané du tissu à un moment donné, l’imagerie intravitale peut suivre les événements intercellulaires et subcellulaires au sein du même tissu au fil du temps. En particulier, les progrès dans le marquage de fluorescence et le développement de rapporteurs moléculaires ont permis de corréler les événements moléculaires avec les comportements cellulaires, tels que la prolifération, la mort, la motilité et l’interaction avec d’autres cellules ou la matrice extracellulaire. La plupart des techniques de MIV sont basées sur la microscopie à fluorescence, ce qui, en raison de la diffusion de la lumière, rend l’imagerie des tissus plus profonds difficile. Le tissu d’intérêt doit donc souvent être exposé chirurgicalement avec une procédure souvent invasive et terminale. Ainsi, selon le site de l’organe, le tissu peut être imagé en continu pendant une période variant de quelques-uns à 40 h8. Alternativement, l’insertion chirurgicale d’une fenêtre d’imagerie permanente permet l’imagerie séquentielle du même tissu sur une période de jours àsemaines 7,9.
Le développement de nouvelles fenêtres d’imagerie a été mis en évidence comme un besoin technologique pour améliorer encore les approches d’imagerie intravitale10. La fenêtre d’imagerie intravitale prototypique est un anneau métallique contenant un couvercle en verre fixé à la peau avec des sutures11. L’interférence avec la libre circulation, l’accumulation d’exsudat et les dommages à la glissière de couverture en verre sont des problèmes courants observés lors de l’utilisation de telles fenêtres. De plus, la fenêtre prototypique nécessite une production spécialisée et la procédure chirurgicale peut nécessiter une formation approfondie. Pour résoudre ces problèmes, le polydiméthylsiloxane (PDMS), un polymère de silicone, qui a déjà été utilisé dans les fenêtres crâniennes pour l’imagerie à long terme dans le cerveau12, a été adapté pour une utilisation dans l’imagerie des organes abdominaux et des glandes mammaires. Ici, une méthode détaillée pour générer des fenêtres en silicone à base de PDMS est présentée, y compris comment couler la fenêtre autour d’une grille en acier inoxydable pour fournir des repères pour l’imagerie répétée des mêmes régions tissulaires. En outre, une procédure chirurgicale simple et sans couture pour insérer la fenêtre sur les organes abdominaux ou la glande mammaire est décrite. Cette nouvelle approche permet de surmonter certains des problèmes les plus courants liés aux fenêtres d’imagerie actuellement utilisées et d’accroître l’accessibilité de l’imagerie intravitale longitudinale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les fenêtres d’imagerie intravitale sont des outils importants pour visualiser directement les processus physiologiques et pathologiques à la résolution cellulaire au fur et à mesure qu’ils se déroulent au fil du temps. La nouvelle procédure décrite pour la coulée et l’insertion de fenêtres d’imagerie flexibles en silicone chez la souris surmonte certains des problèmes les plus courants avec les fenêtres d’imagerie actuellement utilisées (exsudat, rupture et interférence avec la mobilité normale),…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Rob Eifert pour son aide dans la conception et l’optimisation des grilles en acier inoxydable découpées au laser. Ce travail a été soutenu par le CSHL Cancer Center (P30-CA045508) et des fonds pour M.E. des National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 et 5P01CA013106-49); CSHL et Northwell Health; la Fondation de la famille Thompson; Nager à travers l’Amérique; et une subvention de la Fondation Simons à CSHL. M.S. a été soutenu par le National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) et le National Cancer Institute du NIH sous le numéro d’attribution 1F30CA253993-01. L.M. est soutenu par une bourse postdoctorale de la Fondation James S. McDonnell. J.M.A. est récipiendaire d’une bourse postdoctorale de l’Institut de recherche sur le cancer et Irvington (Prix CRI no 3435). D.A.T. est soutenu par le Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research et la Thompson Family Foundation. Les dessins animés ont été créés avec Biorender.com.
Materials
| 3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape | 3M | 70200770819 | |
| Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | N267H | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 22974 | |
| AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products Co. | ||
| Acqknowledge software and sensors | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Antibody | Abcam | ab125212 | |
| Curity gauze sponges | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Two-part, 10:1 mixing ratio |
| Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro 3D printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Far Infrared Heated blanket | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Receptor Blocker | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Fiji imaging processing package | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Gating system: | BIOPAC Systems Inc. | The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems. | |
| Acqknowledge software | ACK100W, ACK100M | ||
| Diff. Amp. Module, C Series | DA100C | ||
| Dual Gating Sys small animal | DTU200 | ||
| MP160 for Windows – Analysis system | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V;015000 | ||
| Pressure Pad | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Absorbable gelatin sponge |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody | R&D Systems | AF3667 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP mice | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | Servohydraulic material testing machine | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST probe | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. | ||
| Polylactic acid filament | Hatchbox | 1.75 mm diameter | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 wound clips | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Stainless steel grid | Fotofab | One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square. | |
| Surface Treated SterileTissue Culture Plates | Fisher Scientific | FB012929 | Lid used as curing surface for imaging windows |
| TriM Scope Multiphoton Microscope | LaVision BioTec | Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr |
|
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48404-453 |
References
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