הדמיה תוך-ורידית אורכית דרך חלונות סיליקון שקופים
Summary
כאן מוצגת גישה להדמיה תוך-ורידית ארוכת טווח באמצעות חלונות סיליקון שקופים אופטית, הניתנים להדבקה ישירות לרקמה/איבר המעניין ולעור. חלונות אלה זולים ורב-תכליתיים יותר מאחרים הנהוגים כיום בשטח, וההחדרה הכירורגית גורמת לדלקת מוגבלת ולמצוקה לבעלי החיים.
Abstract
מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM) מאפשרת הדמיה של תנועת תאים, חלוקה ומוות ברזולוציה של תא בודד. IVM דרך חלונות הדמיה שהוכנסו בניתוח הוא חזק במיוחד מכיוון שהוא מאפשר תצפית אורכית של אותה רקמה במשך ימים עד שבועות. חלונות הדמיה טיפוסיים כוללים כיסוי זכוכית במסגרת מתכת תואמת ביולוגית הנתפרת לעור העכבר. חלונות אלה יכולים להפריע לתנועה החופשית של העכברים, לעורר תגובה דלקתית חזקה, ולהיכשל עקב זכוכית שבורה או תפרים קרועים, שכל אחד מהם עשוי להצריך המתת חסד. כדי להתמודד עם בעיות אלה, פותחו חלונות להדמיה ארוכת טווח של איברי בטן ובלוטות החלב מסרט דק של פולידימתילסילוקסן (PDMS), פולימר סיליקון צלול אופטית ששימש בעבר להדמיית חלונות הדמיה גולגולתיים. חלונות אלה יכולים להיות מודבקים ישירות לרקמות, ובכך להפחית את הזמן הדרוש להחדרה. PDMS הוא גמיש, ותורם לעמידותו בעכברים לאורך זמן – עד 35 יום נבדקו. הדמיה אורכית היא הדמיה של אותו אזור רקמה במהלך מפגשים נפרדים. רשת נירוסטה הוטמעה בתוך החלונות כדי למקם את אותו אזור, מה שאפשר הדמיה של תהליכים דינמיים (כמו אינבולוציה של בלוטת החלב) באותם מקומות, בהפרש של ימים ספורים זה מזה. חלון סיליקון זה איפשר גם ניטור של תאים סרטניים בעלי תפוצה יחידה המתפתחים למיקרו-גרורות לאורך זמן. חלונות הסיליקון ששימשו במחקר זה פשוטים יותר להחדרה מאשר חלונות זכוכית ממוסגרים במתכת וגורמים לדלקת מוגבלת של הרקמות המצולמות. יתר על כן, רשתות משובצות מאפשרות מעקב פשוט אחר אותו אזור רקמה במפגשי הדמיה חוזרים ונשנים.
Introduction
מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM), הדמיה של רקמות בבעלי חיים מורדמים, מציעה תובנות על הדינמיקה של אירועים פיזיולוגיים ופתולוגיים ברזולוציה תאית ברקמות שלמות. היישומים של טכניקה זו משתנים מאוד, אך IVM סייע בתחום הביולוגיה של הסרטן כדי לעזור להבהיר כיצד תאים סרטניים פולשים לרקמות וגרורות, מתקשרים עם המיקרו-סביבה שמסביב ומגיבים לתרופות 1,2,3. בנוסף, IVM היה המפתח לקידום ההבנה של המנגנונים המורכבים השולטים בתגובות החיסוניות על ידי מתן תובנות המשלימות לגישות פרופיל ex vivo (למשל, ציטומטריה של זרימה). לדוגמה, ניסויי הדמיה תוך-ורידיים חשפו פרטים על תפקודי מערכת החיסון בכל הקשור לנדידת תאים ולמגע בין תאים, והציעו פלטפורמה לכמות הדינמיקה המרחבית-טמפורלית בתגובה לפציעה או לזיהום 4,5,6,7. רבים מהתהליכים הללו יכולים להיחקר גם באמצעות כתמים היסטולוגיים, אך רק IVM מאפשר מעקב אחר שינויים דינמיים. למעשה, בעוד שמקטע היסטולוגי מציע תמונת מצב של הרקמה בזמן נתון, הדמיה תוך-תאית יכולה לעקוב אחר אירועים בין-תאיים ותת-תאיים בתוך אותה רקמה לאורך זמן. בפרט, ההתקדמות בתיוג הפלואורסצנטי והתפתחותם של כתבים מולקולריים אפשרו לאירועים מולקולריים להיות מתואמים עם התנהגויות תאיות, כגון התפשטות, מוות, תנועתיות ואינטראקציה עם תאים אחרים או עם המטריצה החוץ-תאית. רוב טכניקות IVM מבוססות על מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, אשר בשל פיזור אור, מה שהופך את ההדמיה של רקמות עמוקות יותר למאתגרת. הרקמה המעניינת, אם כן, צריכה לעתים קרובות להיחשף בניתוח בהליך פולשני וסופי לעתים קרובות. לכן, בהתאם לאתר האיבר, ניתן לדמות את הרקמה ברציפות במשך תקופה שנעה בין כמה ל -40 שעות8. לחלופין, החדרה כירורגית של חלון הדמיה קבוע מאפשרת הדמיה של אותה רקמה ברצף על פני תקופה של ימים עד שבועות 7,9.
הפיתוח של חלונות הדמיה חדשים הודגש כצורך טכנולוגי לשיפור נוסף של גישות ההדמיה התוך-ויראלית10. חלון ההדמיה התוך-עינית הוא טבעת מתכת המכילה כיסוי זכוכית המחובר לעור עם תפרים11. הפרעה לתנועה חופשית, הצטברות של הפרשה ונזק לכיסוי הזכוכית הם בעיות נפוצות שנראו בשימוש בחלונות כאלה. יתר על כן, החלון האבטיפוסי דורש ייצור מיוחד, וההליך הכירורגי יכול לדרוש הכשרה נרחבת. כדי לטפל בבעיות אלה, פולידימתילסילוקסן (PDMS), פולימר סיליקון, ששימש בעבר בחלונות גולגולת להדמיה ארוכת טווח במוח12, הותאם לשימוש בהדמיית איברי בטן ובלוטת החלב. כאן מוצגת שיטה מפורטת ליצירת חלונות סיליקון מבוססי PDMS, כולל כיצד להטיל את החלון סביב רשת נירוסטה כדי לספק ציוני דרך להדמיה חוזרת של אותם אזורי רקמה. יתר על כן, מתואר הליך כירורגי פשוט ונטול תפרים להחדרת החלון מעל איברי הבטן או בלוטת החלב. גישה חדשה זו מתגברת על כמה מהבעיות הנפוצות ביותר עם חלונות הדמיה הנמצאים בשימוש כיום ומגבירה את הנגישות של הדמיה תוך-ורידית אורכית.
Protocol
Representative Results
Discussion
חלונות הדמיה תוך-ורידיים הם כלים חשובים להדמיה ישירה של תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים ברזולוציה תאית כשהם מתפתחים לאורך זמן. ההליך החדשני המתואר ליציקה והכנסת חלונות הדמיה גמישים מסיליקון בעכברים מתגבר על כמה מהבעיות הנפוצות ביותר עם חלונות הדמיה הנמצאים בשימוש כיום (הפרשה, שבירה והפר…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לרוב אייפרט על עזרתו בתכנון ואופטימיזציה של רשתות הנירוסטה שנחתכו בלייזר. עבודה זו נתמכה על ידי מרכז הסרטן CSHL (P30-CA045508) וכספים עבור M.E. מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (1R01CA2374135 ו- 5P01CA013106-49); CSHL ונורת’וול בריאות; קרן משפחת תומפסון; לשחות ברחבי אמריקה; ומענק מקרן סימונס ל-CSHL. M.S. נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים תוכנית הכשרה למדעים רפואיים (T32-GM008444) והמכון הלאומי לסרטן של NIH תחת פרס מספר 1F30CA253993-01. L.M. נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט של קרן ג’יימס ס. מקדונל. J.M.A. הוא חתן מלגת מכון לחקר הסרטן/מלגת אירווינגטון פוסט-דוקטורט (פרס CRI #3435). D.A.T. נתמך על ידי המעבדה הייעודית של קרן לוסטגרטן לחקר סרטן הלבלב וקרן משפחת תומפסון. קריקטורות נוצרו עם Biorender.com.
Materials
| 3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape | 3M | 70200770819 | |
| Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | N267H | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 22974 | |
| AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products Co. | ||
| Acqknowledge software and sensors | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Antibody | Abcam | ab125212 | |
| Curity gauze sponges | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Two-part, 10:1 mixing ratio |
| Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro 3D printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Far Infrared Heated blanket | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Receptor Blocker | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Fiji imaging processing package | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Gating system: | BIOPAC Systems Inc. | The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems. | |
| Acqknowledge software | ACK100W, ACK100M | ||
| Diff. Amp. Module, C Series | DA100C | ||
| Dual Gating Sys small animal | DTU200 | ||
| MP160 for Windows – Analysis system | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V;015000 | ||
| Pressure Pad | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Absorbable gelatin sponge |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody | R&D Systems | AF3667 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP mice | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | Servohydraulic material testing machine | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST probe | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. | ||
| Polylactic acid filament | Hatchbox | 1.75 mm diameter | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 wound clips | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Stainless steel grid | Fotofab | One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square. | |
| Surface Treated SterileTissue Culture Plates | Fisher Scientific | FB012929 | Lid used as curing surface for imaging windows |
| TriM Scope Multiphoton Microscope | LaVision BioTec | Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr |
|
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48404-453 |
References
- Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
- Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
- Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
- Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
- Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917 (2014).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
- Anderson, T. L. . Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).
- Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
