Imágenes intravitales longitudinales a través de ventanas de silicona transparente
Summary
Aquí se presenta un enfoque para imágenes intravitales a largo plazo utilizando ventanas de silicona ópticamente transparentes que se pueden pegar directamente al tejido / órgano de interés y la piel. Estas ventanas son más baratas y versátiles que otras utilizadas actualmente en el campo, y la inserción quirúrgica causa inflamación y angustia limitadas a los animales.
Abstract
La microscopía intravital (IVM) permite la visualización del movimiento, la división y la muerte celular a resolución de una sola célula. La IVM a través de ventanas de imágenes insertadas quirúrgicamente es particularmente poderosa porque permite la observación longitudinal del mismo tejido durante días o semanas. Las ventanas de imágenes típicas comprenden una cubierta de vidrio en un marco de metal biocompatible suturado a la piel del ratón. Estas ventanas pueden interferir con el libre movimiento de los ratones, provocar una fuerte respuesta inflamatoria y fallar debido a vidrios rotos o suturas rotas, cualquiera de las cuales puede requerir eutanasia. Para abordar estos problemas, se desarrollaron ventanas para imágenes de órganos abdominales y glándulas mamarias a largo plazo a partir de una película delgada de polidimetilsiloxano (PDMS), un polímero de silicona ópticamente transparente utilizado anteriormente para ventanas de imágenes craneales. Estas ventanas se pueden pegar directamente a los tejidos, reduciendo el tiempo necesario para la inserción. PDMS es flexible, lo que contribuye a su durabilidad en ratones a lo largo del tiempo: se han probado hasta 35 días. Las imágenes longitudinales son imágenes de la misma región del tejido durante sesiones separadas. Se incrustó una rejilla de acero inoxidable dentro de las ventanas para localizar la misma región, lo que permitió la visualización de procesos dinámicos (como la involución de la glándula mamaria) en los mismos lugares, con días de diferencia. Esta ventana de silicona también permitió el monitoreo de células cancerosas diseminadas individuales que se convierten en micrometástasis con el tiempo. Las ventanas de silicona utilizadas en este estudio son más fáciles de insertar que las ventanas de vidrio con marco de metal y causan una inflamación limitada de los tejidos fotografiados. Además, las rejillas integradas permiten un seguimiento sencillo de la misma región del tejido en sesiones repetidas de imágenes.
Introduction
La microscopía intravital (IVM), la imagen de tejidos en animales anestesiados, ofrece información sobre la dinámica de eventos fisiológicos y patológicos a resolución celular en tejidos intactos. Las aplicaciones de esta técnica varían ampliamente, pero la IVM ha sido fundamental en el campo de la biología del cáncer para ayudar a dilucidar cómo las células cancerosas invaden los tejidos y hacen metástasis, interactúan con el microambiente circundante y responden a los medicamentos 1,2,3. Además, la IVM ha sido clave para avanzar en la comprensión de los complejos mecanismos que gobiernan las respuestas inmunes al proporcionar información complementaria a los enfoques de perfiles ex vivo (por ejemplo, citometría de flujo). Por ejemplo, los experimentos de imágenes intravitales han revelado detalles sobre las funciones inmunes en relación con la migración celular y el contacto célula-célula y han ofrecido una plataforma para cuantificar la dinámica espaciotemporal en respuesta a una lesión o infección 4,5,6,7. Muchos de estos procesos también se pueden estudiar a través de la tinción histológica, pero solo la IVM permite el seguimiento de los cambios dinámicos. De hecho, mientras que una sección histológica ofrece una instantánea del tejido en un momento dado, las imágenes intravitales pueden rastrear eventos intercelulares y subcelulares dentro del mismo tejido a lo largo del tiempo. En particular, el progreso en el etiquetado de fluorescencia y el desarrollo de reporteros moleculares han permitido que los eventos moleculares se correlacionen con comportamientos celulares, como la proliferación, la muerte, la motilidad y la interacción con otras células o la matriz extracelular. La mayoría de las técnicas de IVM se basan en la microscopía de fluorescencia, que debido a la dispersión de la luz, hace que las imágenes de tejidos más profundos sean un desafío. El tejido de interés, por lo tanto, a menudo necesita ser expuesto quirúrgicamente con un procedimiento a menudo invasivo y terminal. Por lo tanto, dependiendo del sitio del órgano, el tejido se puede visualizar continuamente durante un período que varía de unos pocos a 40 h8. Alternativamente, la inserción quirúrgica de una ventana de imagen permanente permite la obtención de imágenes del mismo tejido secuencialmente durante un período de días a semanas 7,9.
El desarrollo de nuevas ventanas de imagen se ha destacado como una necesidad tecnológica para mejorar aún más los enfoques de imagen intravital10. La ventana de imagen intravital prototípica es un anillo metálico que contiene una funda de vidrio asegurada a la piel con suturas11. La interferencia con el libre movimiento, la acumulación de exudado y el daño a la cubierta de vidrio son problemas comunes que se observan con el uso de tales ventanas. Además, la ventana prototípica requiere una producción especializada, y el procedimiento quirúrgico puede requerir una capacitación extensa. Para abordar estos problemas, el polidimetilsiloxano (PDMS), un polímero de silicona, que anteriormente se ha utilizado en ventanas craneales para imágenes a largo plazo en el cerebro12, se adaptó para su uso en imágenes de órganos abdominales y glándulas mamarias. Aquí, se presenta un método detallado para generar ventanas de silicona basadas en PDMS, que incluye cómo fundir la ventana alrededor de una rejilla de acero inoxidable para proporcionar puntos de referencia para imágenes repetidas de las mismas regiones de tejido. Además, se describe un procedimiento quirúrgico simple y sin puntos de sutura para insertar la ventana sobre los órganos abdominales o la glándula mamaria. Este nuevo enfoque supera algunos de los problemas más comunes con las ventanas de imágenes utilizadas actualmente y aumenta la accesibilidad de las imágenes intravitales longitudinales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las ventanas de imágenes intravitales son herramientas importantes para visualizar directamente los procesos fisiológicos y patológicos a resolución celular a medida que se desarrollan con el tiempo. El novedoso procedimiento descrito para fundir e insertar ventanas de imágenes de silicona flexibles en ratones supera algunos de los problemas más comunes con las ventanas de imágenes utilizadas actualmente (exudado, rotura e interferencia con la movilidad normal), proporciona seguridad adicional para el ratón y aum…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Rob Eifert por su ayuda en el diseño y optimización de las rejillas de acero inoxidable cortadas con láser. Este trabajo fue apoyado por el CSHL Cancer Center (P30-CA045508) y fondos para M.E. de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (1R01CA2374135 y 5P01CA013106-49); CSHL y Northwell Health; la Fundación de la Familia Thompson; Nadar a través de América; y una subvención de la Fundación Simons a CSHL. M.S. fue apoyado por el National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) y el National Cancer Institute of the NIH bajo el número de premio 1F30CA253993-01. L.M. cuenta con el apoyo de una beca postdoctoral de la Fundación James S. McDonnell. J.M.A. ha recibido una beca postdoctoral del Instituto de Investigación del Cáncer/Irvington (Premio CRI #3435). D.A.T. cuenta con el apoyo del Laboratorio Dedicado a la Investigación del Cáncer de Páncreas de la Fundación Lustgarten y la Fundación de la Familia Thompson. Los dibujos animados fueron creados con Biorender.com.
Materials
| 3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape | 3M | 70200770819 | |
| Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | N267H | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 22974 | |
| AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products Co. | ||
| Acqknowledge software and sensors | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Antibody | Abcam | ab125212 | |
| Curity gauze sponges | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Two-part, 10:1 mixing ratio |
| Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro 3D printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Far Infrared Heated blanket | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Receptor Blocker | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Fiji imaging processing package | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Gating system: | BIOPAC Systems Inc. | The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems. | |
| Acqknowledge software | ACK100W, ACK100M | ||
| Diff. Amp. Module, C Series | DA100C | ||
| Dual Gating Sys small animal | DTU200 | ||
| MP160 for Windows – Analysis system | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V;015000 | ||
| Pressure Pad | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Absorbable gelatin sponge |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody | R&D Systems | AF3667 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP mice | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | Servohydraulic material testing machine | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST probe | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. | ||
| Polylactic acid filament | Hatchbox | 1.75 mm diameter | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 wound clips | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Stainless steel grid | Fotofab | One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square. | |
| Surface Treated SterileTissue Culture Plates | Fisher Scientific | FB012929 | Lid used as curing surface for imaging windows |
| TriM Scope Multiphoton Microscope | LaVision BioTec | Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr |
|
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48404-453 |
References
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