Études des interactions chaperonne-cochapéroé à l’aide d’un essai homogène à base de billes

Summary

Ce protocole présente une technique pour sonder les interactions protéine-protéine à l’aide de perles de donneur liées au glutathion avec des co-chaperons à motif TPR fusionnés GST et des perles accepteurs couplées à un peptide dérivé de Hsp90. Nous avons utilisé cette technique pour dépister de petites molécules afin de perturber les interactions Hsp90-FKBP51 ou Hsp90-FKBP52 et identifié des inhibiteurs puissants et sélectifs de l’interaction Hsp90-FKBP51.

Abstract

Le ciblage des interactions protéine de choc thermique 90 (Hsp90)-cochaperone offre la possibilité de réguler spécifiquement les processus intracellulaires dépendants de Hsp90. Le pentapeptide MEEVD conservé à la terminaison C de Hsp90 est responsable de l’interaction avec le motif de répétition tétratricopeptide (TPR) des co-chaperons. FK506-binding protein (FKBP) 51 et FKBP52 sont deux co-chaperons similaires à motif TPR impliqués dans des maladies hormono-dépendantes stéroïdiennes avec des fonctions différentes. Par conséquent, l’identification de molécules bloquant spécifiquement les interactions entre Hsp90 et FKBP51 ou FKBP52 offre un potentiel thérapeutique prometteur pour plusieurs maladies humaines. Nous décrivons ici le protocole d’un test homogène de proximité luminescente amplifié pour sonder les interactions entre Hsp90 et ses co-chaperons partenaires FKBP51 et FKBP52. Tout d’abord, nous avons purifié les protéines FKBP51 et FKBP52 contenant des motifs TPR sous forme marquée glutathion S-transférase (GST). En utilisant les perles de donneur liées au glutathion avec des protéines À motif TPR fusionnées à la TPS et les perles accepteurs couplées à un peptide C-terminal 10-mer de Hsp90, nous avons sondé les interactions protéine-protéine dans un environnement homogène. Nous avons utilisé ce test pour dépister de petites molécules afin de perturber les interactions Hsp90-FKBP51 ou Hsp90-FKBP52 et identifié des inhibiteurs puissants et sélectifs de l’interaction Hsp90-FKBP51.

Introduction

Les chaperons moléculaires contribuent à l’homéostasie des protéines, y compris le repliement, le transport et la dégradation des protéines. Ils régulent plusieurs processus cellulaires et sont liés à de nombreuses maladies telles que le cancer et les maladies neurodégénératives¹. La protéine de choc thermique 90 (Hsp90) est l’un des chaperons les plus importants dont la fonction dépend des changements conformationnels entraînés par l’hydrolyse de l’ATP et la liaison avec les protéines clientes médiées par ses co-chaperons^2. Malgré un potentiel évident de Hsp90 en tant que cible thérapeutique, affiner sa fonction représente un grand défi. Il existe plusieurs inhibiteurs de Hsp90 ciblant la région de liaison de l’ATP N-terminal, qui ont été évalués dans des essais cliniques, mais aucun d’entre eux n’a été approuvé pour la^{commercialisation 3}. En raison de l’absence d’une poche de liaison au ligand⁴bien définie, le ciblage de la région C-terminale de Hsp90 a eu un succès limité⁴. Récemment, la perturbation des interactions Hsp90-cochaperone par de petites molécules a été étudiée comme stratégie alternative^5. Le ciblage des interactions Hsp90-cochaperone ne provoquerait pas de réponse générale au stress cellulaire et offre la possibilité de réguler spécifiquement divers processus intracellulaires. Le pentapeptide MEEVD conservé à la terminaison C de Hsp90 est responsable de l’interaction avec le motif de répétition tétratricopeptide (TPR) des co-chaperons⁶. Sur les 736 protéines contenant des motifs TPR annotées dans la base de données des protéines humaines, environ 20 protéines différentes interagissent avec Hsp90 via ce peptide^7. Les molécules en concurrence pour la liaison peptidique MEEVD perturberaient les interactions entre Hsp90 et les co-chaperons contenant un domaine TPR. Le site de liaison peptidique a une structure tertiaire similaire, mais l’homologie globale entre les différents domaines du motif TPR est relativement faible^7,ce qui offre la possibilité d’identifier des molécules spécifiquement capables de bloquer les interactions entre Hsp90 et des co-chaperons particuliers à motif TPR. Parmi ces co-chaperons à motif TPR, la protéine de liaison FK506 (FKBP) 51 et FKBP52 sont des régulateurs de la signalisation des récepteurs hormonaux stéroïdiens (SHR) et impliqués dans plusieurs maladies hormono-dépendantes des stéroïdes, y compris le cancer, les maladies liées au stress, les maladies métaboliques et la maladie d’Alzheimer⁸. Bien que FKBP51 et FKBP52 partagent > similitude de séquence de 80%, leurs fonctions diffèrent: FKBP52 est un régulateur positif de l’activité SHR, tandis que FKBP51 est un régulateur négatif dans la plupart des cas⁸. Par conséquent, l’identification de molécules, bloquant spécifiquement les interactions entre Hsp90 et FKBP51 ou FKBP52, offre un potentiel thérapeutique prometteur pour les maladies connexes.

Unessai amplifié Luminescent Proximity Homogenous A(AlphaScreen) a été développé pour la première fois en 1994 par Ullman EF et al.^9. Maintenant, il est largement utilisé pour détecter différents types d’interactions biologiques, telles que le^{peptide 10,}la protéine^11,l’ADN^12,l’ARN¹³et le sucre^14. Dans cette technique, il existe deux types de perles (diamètre 200 nm), l’une est la perle donneuse et l’autre est la perle accepteuse. Les biomolécules sont immobilisées sur ces perles; leurs interactions biologiques rapprochent les perles donneuses et accepteuses. À 680 nm, un photosensibilisateur dans la perle du donneur éclaire et convertit l’oxygène en oxygène syté. Parce que l’oxygène syt a une courte durée de vie, il ne peut diffuser que jusqu’à 200 nm. Si la bille accepteur est à proximité, son dérivé de thioxène réagit avec l’oxygène singulet générant une chimiluminescence à 370 nm. Cette énergie active en outre les fluorophores dans la même bille accepteur pour émettre de la lumière à 520-620 nm¹⁵. Si les interactions biologiques sont perturbées, la perle accepteur et la perle donneuse ne peuvent pas atteindre la proximité, ce qui entraîne la désintégration de l’oxygène syulet et un faible signal produit.

Nous décrivons ici un protocole utilisant cette technique pour le criblage de petites molécules inhibant les interactions entre Hsp90 et les co-chaperons TPR, en particulier FKBP51 et FKBP52. Les 10 peptides longs d’acides aminés correspondant à Hsp90 extrême C-terminus sont attachés à des billes acceptrices. Les co-chaperons TPR purifiés marqués de la TPS interagissent avec les perles de donneurs liées au glutathion. Lorsque l’interaction entre les peptides dérivés de Hsp90 et les co-chaperons à motif TPR rassemble les billes, un signal amplifié est produit(Figure 1A). Si les petites molécules criblées peuvent inhiber les interactions entre Hsp90 et les co-chaperons à motif TPR, ce signal amplifié sera diminué(Figure 1B). Leur IC₅₀ peut être calculé par mesure quantitative. Ce protocole peut être étendu à toutes les interactions chaperon -TPR-motif co-chaperon d’intérêt et est d’une grande importance dans le développement de nouvelles molécules, bloquant spécifiquement l’interaction entre Hsp90 et FKBP51 ou FKBP52.

Figure 1: Principe de base de ce test. (A) La GST-FKBP51 purifiée interagit avec les billes de donneur liées au glutathion. Les 10 peptides longs d’acides aminés correspondant à l’extrême C-terminus de Hsp90 sont attachés à des billes acceptrices. L’interaction entre les peptides dérivés de Hsp90 et le domaine TPR de FKBP51 rapproche les perles donneuses et acceptrices. À 680 nm, un photosensibilisateur dans la perle du donneur éclaire et convertit l’oxygène en oxygène syté. Le dérivé de thioxène sur la bille accepteur réagit avec l’oxygène syt et génère une chimiluminescence à 370 nm. Cette énergie active en outre les fluorophores dans la même bille accepteur pour émettre de la lumière à 520-620 nm. (B) Lorsque de petites molécules inhibent les interactions entre Hsp90 et FKBP51, les perles donneuses et acceptatrices ne peuvent pas atteindre la proximité. Ensuite, l’oxygène syt avec une courte durée de vie se désintègre et aucun signal détectable n’est produit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

Remarque : Une vue d’ensemble de ce protocole est illustrée à la figure 2. 1. Expression et purification de la TPS-FKBP51 et de la TPS-FKBP52 (Figure 2A) PlasmidesREMARQUE: Obtenez des clones d’ADNc pour FKBP51 humain (id de clone: 5723416) et pour FKBP52 humain (ID de clone: 7474554) auprès du consortium IMAGE. Amplifier l’ADN FKBP51 humain par PCR avec des amorces (en avant; 5’GGATCCA…

Representative Results

Dans notre essai, le facteur Z’ et le rapport S/B sont respectivement de 0,82 et 13,35(figure 3A),ce qui démontre que notre essai est robuste et fiable pour le criblage à haut débit. Nous l’avons ensuite utilisé pour filtrer de petits composés de masse moléculaire. La figure 3B présente l’inhibition dose-dépendante des interactions chaperon-cochaperone avec une petite molécule sélectionnée (D10). Les courbes dose-réponse pour D10 sont générées…

Discussion

Nous décrivons ici un protocole utilisant le test pour le criblage de petites molécules inhibant les interactions entre Hsp90 et les co-chaperons à motif TPR, en particulier FKBP51 et FKBP52. Son score Z’ élevé (>0,8) démontre la robustesse et la fiabilité d’un format à haut débit. Les résultats peuvent être obtenus en une heure et de petites quantités de perles, de protéines et de composés sont nécessaires. De plus, ce protocole pourrait facilement être étendu à toutes les interactions de co-chaperon…

Materials

384-well plates	Perkin Elmer	6008350	Assay volume 25 ml
Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit	Millipore	UFC901008	Concentrate protein
Ampicillin	Sigma	A0166	Antibiotics
Bacteria shaker Unimax 1010	Heidolph		Culture bacteria
cDNA clones for human FKBP51	Source BioScience	clone id: 5723416	pCMV-SPORT6 vector
cDNA clones for human FKBP52	Source BioScience	clone id: 7474554	pCMV-SPORT6 vector
Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C602003	One Shot BL21 Star (DE3)
Data analysis software	GraphPad Prism	9.0.0	Analysis data and make figures
Data analysis software	Excel		Analysis data
DMSO	Supelco	1.02952.1000	Dilute compounds
DPBS	Gibco	14190-144	Prepare solution
EDTA	Calbiochem	344504	Prevent proteolysis during sonication
Glutathione	Sigma	G-4251	Elute GST-tagged proteins
Glutathione donor beads	Perkin Elmer	6765300	Donor bead
GST-trap column	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	Purify GST-tagged proteins
Isopropyl-β-D-thiogalactoside	Thermo Fisher Scientific	R0392	Induce protein expression
LB Broth (Miller)	Sigma	L3522	Microbial growth medium
PCR instrument	BIO-RAD	S1000 Thermal Cycler	Amplification/PCR
PD-10 column	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	Solution exchange
pGEX-6P-1 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	Plasmid
pGEX-6P-2 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954650	Plasmid
Plate reader	Perkin Elmer	EnSpire 2300 Multilabel Reader	Read alpha plate
Plate reader software	Perkin Elmer	EnSpire Manager	Plate reader software
Plate reader software protocol	Perkin Elmer	Alpha 384-well Low volume	Use this protocol to read plate
PMSF	Sigma	P7626	Prevent proteolysis during sonication
protease inhibitor cocktail	Sigma	S8830	Prevent proteolysis during sonication
Sodium azide	Sigma	S2002	As a preservative
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)	Sigma	156159	Activates matrix for coupling
Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform	Peptide 2.0 inc		Synthesize Hsp90 C-terminal peptide
Test-Tube Rotator	LABINCO		Make end-over-end agitation
Tris-HCl	Sigma	10708976001	Block unreacted sites of acceptor beads
Tween-20	Sigma	P1379	Prevent beads aggregation
Ultra centrifuge Avanti J-20 XP	Beckman Coulter		Centrifuge to get bacteria cell pellets
Ultrasonic cell disruptor	Microson		Sonicate cells to release protein
Unconjugated acceptor beads	Perkin Elmer	6762003	Acceptor beads
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module	Invitrogen	EI0002	SDS-PAGE