Studier av förkläde-cokaperoninteraktioner med homogen pärlbaserad analys

Summary

Detta protokoll presenterar en teknik för sondering protein-protein interaktioner med glutation-kopplade donator pärlor med GST-smälta TPR-motiv co-chaperones och acceptor pärlor i kombination med en Hsp90-härledda peptid. Vi har använt denna teknik för att screena små molekyler för att störa Hsp90-FKBP51 eller Hsp90-FKBP52 interaktioner och identifierat potenta och selektiva Hsp90-FKBP51 interaktionshämmare.

Abstract

Inriktning på värmechockprotein 90 (Hsp90)-cochaperone interaktioner ger möjlighet att specifikt reglera Hsp90-beroende intracellulära processer. Den bevarade MEEVD pentapeptiden vid C-ändstationen i Hsp90 är ansvarig för interaktionen med tetratricopeptidrepetitionsmotivet (TPR) av co-chaperones. FK506-bindande protein (FKBP) 51 och FKBP52 är två liknande TPR-motiv co-chaperones inblandade i steroidhormon-beroende sjukdomar med olika funktioner. Att identifiera molekyler som specifikt blockerar interaktioner mellan Hsp90 och FKBP51 eller FKBP52 ger därför en lovande terapeutisk potential för flera mänskliga sjukdomar. Här beskriver vi protokollet för en förstärkt luminescent närhet homogen analys för sond interaktioner mellan Hsp90 och dess partner co-chaperones FKBP51 och FKBP52. För det första har vi renat TPR-motivinnehållande proteiner FKBP51 och FKBP52 i glutation S-transferase (GST)-märkt form. Med hjälp av glutation-kopplade donatorpärlor med GST-smälta TPR-motiv proteiner och acceptor pärlor i kombination med en 10-mer C-terminal peptid av Hsp90, har vi sonderat protein-protein interaktioner i en homogen miljö. Vi har använt denna analys för att screena små molekyler för att störa Hsp90-FKBP51 eller Hsp90-FKBP52 interaktioner och identifierat potenta och selektiva Hsp90-FKBP51 interaktionshämmare.

Introduction

Molekylära förkläde bidrar till proteinhomeostas, inklusive proteinveckning, transport och nedbrytning. De reglerar flera cellulära processer och är kopplade till många sjukdomar som cancer och neurodegenerativa sjukdomar¹. Värmechockprotein 90 (Hsp90) är ett av de viktigaste förklädena vars funktion är beroende av konformationsförändringar som drivs av ATP-hydrolys och bindning med klientproteiner medierade av dess co-chaperones². Trots en uppenbar potential hos Hsp90 som terapeutiskt mål, finjusterar dess funktion representerar en stor utmaning. Det finns flera Hsp90-hämmare riktade mot N-terminal ATP-bindningsregionen, som har utvärderats i kliniska prövningar, men ingen av dem har godkänts för marknadsföring³. På grund av bristen på en väldefinierad ligand-bindande^{ficka 4}, inriktning på C-terminal regionen Hsp90 har haft begränsad framgång⁴. Nyligen har störningar av Hsp90-cochaperone interaktioner av små molekyler undersökts som en alternativ strategi⁵. Att rikta in sig på Hsp90-cochaperone interaktioner skulle inte framkalla allmänna cell stress svar och ger möjlighet att specifikt reglera olika intracellulära processer. Den bevarade MEEVD pentapeptiden vid C-ändstationen i Hsp90 är ansvarig för interaktionen med tetratricopeptidrepetitionsmotivet (TPR) av co-chaperones⁶. Av de 736 TPR-motivinnehållande proteinerna som kommenteras i den mänskliga proteindatabasen interagerar ~ 20 olika proteiner med Hsp90 via denna peptid⁷. Molekyler som konkurrerar om MEEVD-peptidbindning skulle störa interaktionerna mellan Hsp90 och co-chaperones som innehåller en TPR-domän. Peptidbindningsstället har liknande tertiär struktur men den övergripande homologin mellan olika TPR-motivdomäner är relativt^{låg 7}, vilket ger en möjlighet att identifiera molekyler som specifikt kan blockera interaktioner mellan Hsp90 och vissa TPR-motiv co-chaperones. Bland dessa TPR-motiv co-chaperones, FK506-bindande protein (FKBP) 51 och FKBP52 är regulatorer av steroidhormon receptorn (SHR) signalering och inblandade i flera steroidhormon-beroende sjukdomar inklusive cancer, stressrelaterade sjukdomar, metabola sjukdomar, och Alzheimers sjukdom⁸. Även om FKBP51 och FKBP52 delar > 80% sekvenslikhet, skiljer sig deras funktioner: FKBP52 är en positiv regulator för SHR-aktivitet, medan FKBP51 i de flesta fall är en negativ regulator⁸. Att identifiera molekyler, som specifikt blockerar interaktioner mellan Hsp90 och FKBP51 eller FKBP52, ger därför en lovande terapeutisk potential för relaterade sjukdomar.

Enmplified Luminescent Proximity Homogen Assay (AlphaScreen) utvecklades först 1994 av Ullman EF et al.⁹. Nu används det ofta för att upptäcka olika typer av biologiska interaktioner, såsom peptid¹⁰, protein^11,DNA^12,RNA¹³, och socker¹⁴. I denna teknik finns det två typer av pärlor (diameter 200 nm), en är donatorplädren och den andra är acceptorpläd. Biomolekylerna är immobiliserade på dessa pärlor; deras biologiska interaktioner för donator- och acceptorpärlor i närheten. Vid 680 nm lyser en ljuskänslig i donatorpärlan upp och omvandlar syre till singlet syre. Eftersom singlet syre har en kort livslängd, det kan bara diffusa upp till 200 nm. Om acceptorpärlan är i närheten reagerar dess tiooxenderivat med singlet syre som genererar chemiluminescens vid 370 nm. Denna energi aktiverar ytterligare fluorforer i samma acceptorpläde för att avge ljus vid 520-620 nm¹⁵. Om de biologiska interaktionerna störs kan acceptorpläd och donatorplädla inte nå närheten, vilket resulterar i singlet syreförfall och lågproducerad signal.

Här beskriver vi ett protokoll med denna teknik för screening av små molekyler som hämmar interaktioner mellan Hsp90 och TPR co-chaperones, särskilt FKBP51 och FKBP52. De 10 aminosyra långa peptiderna som motsvarar Hsp90 extrema C-ändstation är fästa vid acceptorpärlor. Renade GST-märkta TPR-co-chaperones interagerar med glutation-länkade donatorpärlor. När interaktionen mellan Hsp90-härledda peptider och TPR-motiv co-chaperones för samman pärlor, produceras en förstärkt signal (Figur 1A). Om de screenade små molekylerna kan hämma interaktionerna mellan Hsp90- och TPR-motivsamförkläde, kommer denna förstärkta signal att minskas (figur 1B). Deras IC₅₀ kan beräknas genom kvantitativ mätning. Detta protokoll kan utvidgas till alla förkläde – TPR-motiv samförkläde interaktioner av intresse och är av stor betydelse i utvecklingen av nya molekyler, specifikt blockerar interaktionen mellan Hsp90 och FKBP51 eller FKBP52.

Figur 1: Den grundläggande principen i dennaanalys. (A) Renad GST-FKBP51 interagerar med glutation-kopplade donatorpärlor. De 10 aminosyra långa peptiderna som motsvarar den extrema C-ändstationen av Hsp90 är fästa vid acceptorpärlor. Interaktionen mellan Hsp90-härledda peptider och TPR-domänen i FKBP51 för donatorn och acceptorpärlor i närheten. Vid 680 nm lyser en ljuskänslig i donatorpärlan upp och omvandlar syre till singlet syre. Tiooxenderivatet på acceptorpärlan reagerar med singlet syre och genererar chemiluminescens vid 370 nm. Denna energi aktiverar ytterligare fluorforer i samma acceptorpläde för att avge ljus vid 520-620 nm. B)När små molekyler hämmar samspelet mellan Hsp90 och FKBP51 kan donatorn och acceptorpärlorna inte nå närheten. Sedan sönderfaller singlet syret med kort livslängd, och ingen detekterbar signal produceras. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Protocol

En översikt över detta protokoll visas i figur 2. 1. Uttryck och rening av GST-FKBP51 och GST-FKBP52 (figur 2A) PlasmiderOBS: Skaffa cDNA-kloner för human FKBP51 (klon-ID: 5723416) och för human FKBP52 (klon-ID: 7474554) från IMAGE-konsortiet. Förstärk det mänskliga FKBP51-DNA:t med PCR med primers (framåt; 5 ‘GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3′, omvänd; 5′-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3’) som inn…

Representative Results

I vår analys är Z faktor- och S/B-förhållande 0,82 respektive 13,35 (figur 3A), vilket visar att vår analys är robust och tillförlitlig för screening med hög genomströmning. Vi använde den sedan för att screena små molekylära massaföreningar. Figur 3B presenterar dosberoende hämning av förkläde-cochaperone interaktioner med en vald liten molekyl (D10). Dos-responskurvorna för D10 genereras av icke-linjär regressionsanalys, baserad på vilken …

Discussion

Här beskriver vi ett protokoll med hjälp av analysen för screening av små molekyler som hämmar interaktioner mellan Hsp90 och TPR-motiv co-chaperones, särskilt FKBP51 och FKBP52. Dess höga Z- poäng (>0,8) visar robustheten och tillförlitligheten för ett höggenomströmningsformat. Resultat kan erhållas inom en timme, och små mängder pärlor, protein och föreningar krävs. Dessutom kan detta protokoll enkelt utvidgas till alla Hsp90/Hsp70 – TPR-motiv samförkläde interaktioner av intresse. Flera TPR-motiv c…

Materials

384-well plates	Perkin Elmer	6008350	Assay volume 25 ml
Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit	Millipore	UFC901008	Concentrate protein
Ampicillin	Sigma	A0166	Antibiotics
Bacteria shaker Unimax 1010	Heidolph		Culture bacteria
cDNA clones for human FKBP51	Source BioScience	clone id: 5723416	pCMV-SPORT6 vector
cDNA clones for human FKBP52	Source BioScience	clone id: 7474554	pCMV-SPORT6 vector
Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C602003	One Shot BL21 Star (DE3)
Data analysis software	GraphPad Prism	9.0.0	Analysis data and make figures
Data analysis software	Excel		Analysis data
DMSO	Supelco	1.02952.1000	Dilute compounds
DPBS	Gibco	14190-144	Prepare solution
EDTA	Calbiochem	344504	Prevent proteolysis during sonication
Glutathione	Sigma	G-4251	Elute GST-tagged proteins
Glutathione donor beads	Perkin Elmer	6765300	Donor bead
GST-trap column	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	Purify GST-tagged proteins
Isopropyl-β-D-thiogalactoside	Thermo Fisher Scientific	R0392	Induce protein expression
LB Broth (Miller)	Sigma	L3522	Microbial growth medium
PCR instrument	BIO-RAD	S1000 Thermal Cycler	Amplification/PCR
PD-10 column	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	Solution exchange
pGEX-6P-1 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	Plasmid
pGEX-6P-2 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954650	Plasmid
Plate reader	Perkin Elmer	EnSpire 2300 Multilabel Reader	Read alpha plate
Plate reader software	Perkin Elmer	EnSpire Manager	Plate reader software
Plate reader software protocol	Perkin Elmer	Alpha 384-well Low volume	Use this protocol to read plate
PMSF	Sigma	P7626	Prevent proteolysis during sonication
protease inhibitor cocktail	Sigma	S8830	Prevent proteolysis during sonication
Sodium azide	Sigma	S2002	As a preservative
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)	Sigma	156159	Activates matrix for coupling
Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform	Peptide 2.0 inc		Synthesize Hsp90 C-terminal peptide
Test-Tube Rotator	LABINCO		Make end-over-end agitation
Tris-HCl	Sigma	10708976001	Block unreacted sites of acceptor beads
Tween-20	Sigma	P1379	Prevent beads aggregation
Ultra centrifuge Avanti J-20 XP	Beckman Coulter		Centrifuge to get bacteria cell pellets
Ultrasonic cell disruptor	Microson		Sonicate cells to release protein
Unconjugated acceptor beads	Perkin Elmer	6762003	Acceptor beads
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module	Invitrogen	EI0002	SDS-PAGE