छोटी और बड़ी आंखों में रेटिना फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक्स विवो इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम के लिए सेटअप और शर्तों का अनुकूलन
Summary
मौजूदा मल्टीइलेक्ट्रोड सरणी या पैच क्लैंप उपकरण का संशोधन एक्स विवो इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम को अधिक व्यापक रूप से सुलभ बनाता है। पूर्व विवो प्रकाश प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने और बनाए रखने के लिए बेहतर तरीके स्वस्थ रेटिना में फोटोरिसेप्टर और ओएन-द्विध्रुवी सेल फ़ंक्शन के अध्ययन की सुविधा प्रदान करते हैं, आंखों की बीमारियों के पशु मॉडल और मानव दाता रेटिना।
Abstract
रेटिना न्यूरोनल प्रकाश प्रतिक्रियाओं के माप स्वस्थ रेटिना के शरीर विज्ञान की जांच करने, रेटिना रोगों में पैथोलॉजिकल परिवर्तनों का निर्धारण करने और चिकित्सीय हस्तक्षेप का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। एक्स विवो इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम (ईआरजी) विशिष्ट औषधीय एजेंटों के अलावा और प्रणालीगत प्रभावों से स्वतंत्र रूप से ऊतक-आंतरिक परिवर्तनों के मूल्यांकन द्वारा पृथक रेटिना में अलग-अलग सेल प्रकारों से योगदान का परिमाणीकरण करने की अनुमति देता है। रेटिना प्रकाश प्रतिक्रियाओं को एक विशेष पूर्व विवो ईआरजी नमूना धारक और रिकॉर्डिंग सेटअप का उपयोग करके मापा जा सकता है, जो मौजूदा पैच क्लैंप या माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी उपकरण से संशोधित है। विशेष रूप से, ओएन-द्विध्रुवी कोशिकाओं का अध्ययन, लेकिन फोटोरिसेप्टर का भी, समय के साथ पूर्व विवो ईआरजी में प्रकाश प्रतिक्रियाओं की धीमी लेकिन प्रगतिशील गिरावट से बाधित हुआ है। छिड़काव की गति में वृद्धि और परफ्यूसेट तापमान का समायोजन पूर्व विवो रेटिना फ़ंक्शन में सुधार करता है और प्रतिक्रिया आयाम और स्थिरता को अधिकतम करता है। एक्स विवो ईआरजी विशिष्ट रूप से व्यक्तिगत रेटिना न्यूरोनल सेल प्रकारों के अध्ययन की अनुमति देता है। इसके अलावा, प्रतिक्रिया आयामों और स्थिरता को अधिकतम करने के लिए सुधार बड़े जानवरों के साथ-साथ मानव दाता आंखों से रेटिना नमूनों में प्रकाश प्रतिक्रियाओं की जांच की अनुमति देता है, जिससे एक्स विवो ईआरजी रेटिना फ़ंक्शन की जांच के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीकों के प्रदर्शनों के प्रदर्शनों के लिए एक मूल्यवान अतिरिक्त बन जाता है।
Introduction
इलेक्ट्रोरेटिनोग्राफी प्रकाश के जवाब में रेटिना फ़ंक्शन कोमापता है 1. यह रेटिना फिजियोलॉजी और पैथोफिज़ियोलॉजी का अध्ययन करने और रेटिना रोगों के लिए उपचार की सफलता को मापने का अभिन्न अंग है। विवो ईआरजी का व्यापक रूप से बरकरार जीवों में रेटिना फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन इसकी महत्वपूर्ण सीमाएं 2,3 हैं। इनमें से, विवो ईआरजी में व्यक्तिगत रेटिना सेल प्रकारों का मात्रात्मक विश्लेषण बाधित होता है, क्योंकि यह संभावित परिवर्तनों के योग को रिकॉर्ड करता है, और इसलिए सभी रेटिना कोशिकाओं सेप्रकाश उत्तेजनाओं तक प्रतिक्रियाओं को ओवरले करता है। इसके अलावा, यह रेटिना में दवाओं को जोड़ने की आसानी से अनुमति नहीं देता है, प्रणालीगत प्रभावों के प्रति संवेदनशील है, और अपेक्षाकृत कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात है। इन नुकसानों को एक्स विवो ईआरजी में समाप्त कर दिया जाता है जो पृथक रेटिना 2,3,5,6 के कार्य की जांच करता है। एक्स विवो ईआरजी फार्माकोलॉजिकल इनहिबिटर और चिकित्सीय एजेंटों के आसान मूल्यांकन के अलावा विशिष्ट रेटिना सेल प्रकारों से बड़ी और स्थिर प्रतिक्रियाओं की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है, जिसे सुपरफ्यूसेट में जोड़ा जा सकता है। साथ ही, यह प्रणालीगत प्रभावों के प्रभावों को दूर करता है और शारीरिक शोर (जैसे, दिल की धड़कन या श्वास) को समाप्त करता है।
पूर्व विवो ईआरजी में, रेटिना या रेटिना नमूने अलग किए जाते हैं और नमूना धारक 3,5 के गुंबद पर फोटोरिसेप्टर-साइड पर लगाए जाते हैं। नमूना धारक को इकट्ठा किया जाता है, एक छिड़काव प्रणाली से जोड़ा जाता है जो रेटिना को गर्म, ऑक्सीजन युक्त मीडिया के साथ आपूर्ति करता है, और एक माइक्रोस्कोप के चरण पर रखा जाता है, जिसे कंप्यूटर-नियंत्रित प्रकाश उत्तेजनाओं को वितरित करने के लिए संशोधित किया गया है। प्रकाश द्वारा प्राप्त प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए, नमूना धारक एक एम्पलीफायर, डिजिटाइज़र और रिकॉर्डिंग सिस्टम से जुड़ा हुआ है (चित्रा 1)। यह तकनीक प्रकाश उत्तेजनाओं के मापदंडों को बदलकर और औषधीय एजेंटों को जोड़कर रॉड और शंकु फोटोरिसेप्टर, ओएन-द्विध्रुवी कोशिकाओं और मुलर ग्लिया से प्रतिक्रियाओं के अलगाव की अनुमति देती है।
एक मौजूदा पैच क्लैंप या मल्टी-इलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) सेटअप को पूर्व विवो ईआरजी रिकॉर्ड करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है, या तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एक्स विवो ईआरजी एडाप्टर या कस्टम पॉली कार्बोनेट कंप्यूटर न्यूमेरिकल कंट्रोल (सीएनसी)-मशीन्ड नमूना धारक के साथ संयोजन में, चूहों जैसे छोटे पशु मॉडल से रेटिना में प्रकाश प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए। यह संशोधन विशेष उपकरणों की आवश्यकता को कम करते हुए एक्स विवो ईआरजी की पहुंच को बढ़ाता है। नमूना धारक का डिजाइन माउंटिंग तकनीक को सरल बनाता है और इलेक्ट्रोड को एकीकृत करता है, जो पहले रिपोर्ट किए गए ट्रांसरेटिनल एक्स विवो ईआरजी विधियों की तुलना में माइक्रोइलेक्ट्रोड्स के हेरफेर की आवश्यकता को समाप्त करताहै। नमूना धारक के अंदर छिड़काव दर और तापमान महत्वपूर्ण कारक हैं जो फोटोरिसेप्टर और ओएन-द्विध्रुवी कोशिकाओं से प्रतिक्रिया गुणों को प्रभावित करते हैं। इन स्थितियों को समायोजित करके, एक्स विवो ईआरजी को लंबे समय तक पृथक माउस रेटिना से मज़बूती से दर्ज किया जा सकता है। अनुकूलित प्रयोगात्मक स्थितियां बड़े रेटिना से रेटिना पंच में एक्स विवो ईआरजी रिकॉर्डिंग की अनुमति देती हैं, जिसमें बड़ी जानवरों की आंखें और मानव दाता आंखेंशामिल हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
मूल रूप से 1865 में होल्मग्रेन द्वारा उभयचर रेटिना10 से रेटिना प्रकाश प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए विकसित किया गया था, तकनीकी बाधाओं ने शुरू में ईआरजी को व्यापक रूप से उपयोग करने से रोका। फिर भी, ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल आई इंस्टीट्यूट अनुदान ईवाई02665 और ईवाई031706 और इंटरनेशनल रेटिना रिसर्च फाउंडेशन द्वारा डॉ विनबर्ग, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ कोर ग्रांट (ईवाई014800) और अंधापन को रोकने के लिए अनुसंधान से अप्रतिबंधित अनुदान, न्यूयॉर्क, एनवाई द्वारा ओप्थाल्मोलॉजी और विजुअल साइंसेज विभाग, यूटा विश्वविद्यालय को समर्थित किया गया था। डॉ. फ्रैंस विनबर्ग अंधेपन को रोकने के लिए एक शोध / डॉ एच जेम्स और कैरोल फ्री करियर डेवलपमेंट अवार्ड के प्राप्तकर्ता भी हैं, और एआरवीओ आईफाइंड अनुदान के डॉ सिल्के बेकर। हम द स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट से डॉ ऐनी हैनेकेन को चित्रा 2 ई में दिखाए गए रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग की जाने वाली दाता आंख प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
References
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