Optimización de la configuración y las condiciones del electrorretinograma ex vivo para estudiar la función de la retina en ojos pequeños y grandes
Summary
La modificación de la matriz de electrodos múltiples existente o del equipo de abrazadera de parche hace que el electrorretinograma ex vivo sea más accesible. Los métodos mejorados para registrar y mantener las respuestas de luz ex vivo facilitan el estudio de la función de los fotorreceptores y las células bipolares ON en la retina sana, modelos animales de enfermedades oculares y retinas de donantes humanos.
Abstract
Las mediciones de las respuestas neuronales a la luz de la retina son fundamentales para investigar la fisiología de la retina sana, determinar los cambios patológicos en las enfermedades de la retina y probar intervenciones terapéuticas. El electrorretinograma ex vivo (ERG) permite la cuantificación de las contribuciones de tipos de células individuales en la retina aislada mediante la adición de agentes farmacológicos específicos y la evaluación de los cambios intrínsecos al tejido independientemente de las influencias sistémicas. Las respuestas a la luz retiniana se pueden medir utilizando un soporte de muestra ERG ex vivo especializado y una configuración de grabación, modificada a partir de la abrazadera de parche existente o el equipo de matriz de microelectrodos. En particular, el estudio de las células ON-bipolares, pero también de los fotorreceptores, se ha visto obstaculizado por la disminución lenta pero progresiva de las respuestas a la luz en el ERG ex vivo a lo largo del tiempo. El aumento de la velocidad de perfusión y el ajuste de la temperatura de perfusión mejoran la función retiniana ex vivo y maximizan la amplitud y estabilidad de la respuesta. El ERG ex vivo permite de manera única el estudio de tipos individuales de células neuronales de la retina. Además, las mejoras para maximizar las amplitudes de respuesta y la estabilidad permiten la investigación de respuestas de luz en muestras de retina de animales grandes, así como en ojos de donantes humanos, lo que hace que el ERG ex vivo sea una valiosa adición al repertorio de técnicas utilizadas para investigar la función de la retina.
Introduction
La electrorretinografía mide la función retiniana en respuesta a la luz1. Es esencial para estudiar la fisiología y fisiopatología de la retina, y medir el éxito de las terapias para las enfermedades de la retina. El ERG in vivo es ampliamente utilizado para evaluar la función retiniana en organismos intactos, pero tiene limitaciones significativas 2,3. Entre estos, el análisis cuantitativo de los tipos de células retinianas individuales en el ERG in vivo se ve obstaculizado, ya que registra la suma de los cambios potenciales y, por lo tanto, las respuestas superpuestas, de todas las células de la retina a los estímulos de luz4. Además, no permite fácilmente la adición de fármacos a la retina, es vulnerable a las influencias sistémicas y tiene una relación señal-ruido relativamente baja. Estas desventajas se eliminan en el ERG ex vivo que investiga la función de la retina aislada 2,3,5,6. El ERG ex vivo permite el registro de respuestas grandes y estables de tipos específicos de células retinianas mediante la adición de inhibidores farmacológicos y una fácil evaluación de los agentes terapéuticos, que se pueden agregar al superfusato. Al mismo tiempo, elimina las influencias de los efectos sistémicos y elimina el ruido fisiológico (por ejemplo, latidos del corazón o respiración).
En el ERG ex vivo, se aíslan retinas o muestras de retina y se montan el lado fotorreceptor hacia arriba en la cúpula del portamuestras 3,5. El portamuestras se ensambla, se conecta a un sistema de perfusión que suministra a la retina medios calentados y oxigenados, y se coloca en el escenario de un microscopio, que se ha modificado para entregar estímulos de luz controlados por computadora. Para registrar las respuestas provocadas por la luz, el portamuestras está conectado a un amplificador, digitalizador y sistema de grabación (Figura 1). Esta técnica permite el aislamiento de las respuestas de los fotorreceptores de bastones y conos, las células bipolares ON y la glía de Müller cambiando los parámetros de los estímulos de luz y agregando agentes farmacológicos.
Una configuración existente de abrazadera de parche o matriz de electrodos múltiples (MEA) se puede convertir para grabar ERG ex vivo, ya sea junto con un adaptador ERG ex vivo disponible comercialmente o un portamuestras mecanizado con control numérico computarizado (CNC) de policarbonato personalizado, para medir las respuestas de luz en retinas de modelos de animales pequeños, como ratones. Esta modificación aumenta la accesibilidad del ERG ex vivo al tiempo que minimiza la necesidad de equipos especializados. El diseño del portamuestras simplifica la técnica de montaje e integra electrodos, eliminando la necesidad de manipulación de microelectrodos en comparación con los métodos ERG ex vivo transretinianos previamente informados7. La velocidad de perfusión y la temperatura dentro del portamuestras son factores importantes que afectan las propiedades de respuesta de los fotorreceptores y las células bipolares ON. Al ajustar estas condiciones, el ERG ex vivo se puede registrar de manera confiable desde la retina aislada del ratón durante períodos prolongados de tiempo. Las condiciones experimentales optimizadas permiten registros ERG ex vivo en punzones retinianos de retinas más grandes, incluidos ojos de animales grandes y ojos de donantes humanos8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Originalmente desarrollado en 1865 por Holmgren para medir las respuestas de luz retiniana de la retina de anfibios10, las limitaciones técnicas inicialmente impidieron que el ERG fuera ampliamente utilizado. Sin embargo, los estudios seminales realizados por Ragnar Granit y otros identificaron los orígenes celulares del ERG y midieron las respuestas de los fotorreceptores y las células bipolares ON ex vivo11,12,13<s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones del Instituto Nacional del Ojo EY02665 y EY031706 y la Fundación Internacional de Investigación de la Retina al Dr. Vinberg, la Subvención Central de los Institutos Nacionales de Salud (EY014800) y una Subvención sin restricciones de Research to Prevent Blindness, Nueva York, NY, al Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales de la Universidad de Utah. El Dr. Frans Vinberg también recibió un Premio de Investigación para Prevenir la Ceguera / Dr. H. James y Carole Free Career Development, y la Dra. Silke Becker de una beca ARVO EyeFind. Anne Hanneken del Instituto de Investigación Scripps por proporcionar el ojo del donante utilizado para las grabaciones que se muestran en la Figura 2E.
Materials
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
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