Kvantitativ analyse af Aspergillus nidulans vækstrate ved hjælp af Live Microscopy og Open Source Software
Summary
Vi præsenterer en etiketfri live imaging protokol ved hjælp af transmitterede lysmikroskopi teknikker til at fange billeder, analysere og kvantificere vækst kinetik af filamentous svamp A. nidulans i både nedsænket kulturer og faste medier. Denne protokol kan bruges sammen med fluorescensmikroskopi.
Abstract
Det er veletableret, at koloni vækst af filamentøse svampe, for det meste afhængig af ændringer i hyphae / mycelia apikale vækstrate, er makroskopisk anslået på størknede medier ved at sammenligne koloni størrelse. Det er imidlertid en udfordring kvantitativt at måle vækstraten for genetisk forskellige svampestammer eller -stammer under forskellige miljø-/vækstbetingelser (pH, temperatur, kulstof- og kvælstofkilder, antibiotika osv.). Således bliver forfølgelsen af komplementære tilgange til kvantificering af vækst kinetiker obligatorisk for bedre at forstå svampecellevækst. Desuden er det velkendt, at filamentøse svampe, herunder Aspergillus spp., har forskellige former for vækst og differentiering under sub-antenne betingelser på solide medier eller nedsænket kulturer. Her beskriver vi en kvantitativ mikroskopisk metode til analyse af vækstkinetik af modelsvampen Aspergillus nidulans, ved hjælp af levende billeddannelse i både nedsænkede kulturer og solide medier. Vi tager billeder, analyserer og kvantificerer vækstrater for forskellige svampestammer på en reproducerbar og pålidelig måde ved hjælp af en open source, gratis software til biobilleder (f.eks. Fiji), på en måde, der ikke kræver nogen forudgående billedanalyseekspertise fra brugeren.
Introduction
Filamentøse svampe er af stor socioøkonomisk og økologisk betydning, idet de begge er afgørende som industrielle / landbrugsmæssige værktøjer til enzym- og antibiotikaproduktion1,2 og som patogener af afgrødeplanter3,skadedyrsinsekter4 og mennesker3. Desuden er filamentøse svampe som Aspergillus nidulans meget udbredt som modelorganismer til grundforskning, såsom undersøgelser i genetik, celle- og evolutionær biologi samt til undersøgelse af hyphalforlængelse5. Filamentøse svampe er stærkt polariserede organismer, der forlænger gennem kontinuerlig forsyning af membran lipider / proteiner og de novo syntese af cellevæg ved den forlængende spids6. En central rolle i hyphal tip vækst og polaritet vedligeholdelse er en specialiseret struktur ved navn ‘Spitzenkorper’ (SPK), en højt bestilt struktur, der hovedsagelig består af cytoskeletale komponenter og polariseret distribution af Golgi6,7,8.
Miljømæssige stimuli / signaler, sådan vand-luft interface, lys, CO2 koncentration, og den ernæringsmæssige status er ansvarlige for de udviklingsmæssige beslutninger truffet af disse forme9. I nedsænkede (flydende) kulturer er differentiering af A. nidulans undertrykt, og væksten opstår ved hyphal tip elongation6. Under vegetativ vækst spirer aseksuel sporer (conidia) ved apikal udvidelse og danner et udifferentieret netværk af indbyrdes forbundne hyphalceller, myceliet, som kan fortsætte med at vokse på ubestemt tid, så længe næringsstoffer og plads er tilgængelige. På den anden side, på solide medier hyphal tips forlænge og efter en defineret periode med vegetativ vækst (udviklingskompetence), aseksuel reproduktion er indledt og antenne conidiophore stilke strækker sig fra specialiserede fodceller i mycelium6. Disse giver anledning til specialiserede udviklingsmæssige flercellede strukturer kaldet conidiophores, som producerer lange kæder af haploid conidia10, der kan genstarte væksten under gunstige miljøforhold.
En udbredt metode til måling af filamentøs svampevækst er at vaccinere sporer på næringsstof agar indeholdt i en petriskål og makroskopisk måle diameteren af kolonien et par dage senere11. Diameteren / området af kolonien, mest afhængig af ændringer i mycelial vækstrate og mindre på conidiophore tæthed12, bruges derefter som en værdi af vækst. Selvom måling af svampepopulationens (koloni) størrelse, der vokser på faste overflader, er helt tilstrækkelig, er det på ingen måde det mest nøjagtige mål for vækst. Sammenlignet med befolkningsgennemsnit (gennemsnit af svampekolonistørrelse) kan målinger af en enkelt celle fange en cellepopulations heterogenitet og gøre det muligt at identificere nye underpopulationer af celler, stater13, dynamik, veje samt de biologiske mekanismer, hvormed celler reagerer på endogene og miljømæssige ændringer14,15. Overvågning svampe cellevækst og fænotype ved time-lapse mikroskopi er velsagtens den mest udbredte kvantitative enkelt celle observation tilgang.
Heri beskriver vi en etiketfri live imaging protokol ved hjælp af transmitterede lysmikroskopiteknikker (såsom fasekontrast, differentialinterferenskontrast (DIC) og polariseret mikroskopi) for at fange billeder, som uafhængigt af den kombinerede brug af fluorescensmikroskopi kan anvendes til at analysere og kvantificere polarvæksten af A. nidulansstammer i både nedsænkede kulturer og faste medier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Overvågning svampecellevækst og fænotype ved time-lapse mikroskopi er en kraftfuld tilgang til at vurdere cellulære adfærd i realtid og kvantitativt og præcist afgøre, om en bestemt lægemiddelbehandling og / eller genetisk intervention resulterer i påviselig cellevækst eller fænotypiske forskelle over tid.
I denne undersøgelse blev en pålidelig live-celle billeddannelsesmetode beskrevet til at måle og kvantitativt analysere svampeudvikling, herunder dynamikken i kimrør og hyphal…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af projektet “En græsk forskningsinfrastruktur til visualisering og overvågning af grundlæggende biologiske processer (BioImaging-GR)” (MIS 5002755), som gennemføres under aktionen “Styrkelse af forsknings- og innovationsinfrastrukturen”, finansieret af det operationelle program “Konkurrenceevne, iværksætteri og innovation” (NSRF 2014-2020) og medfinansieret af Grækenland og EU.
Materials
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
References
- Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).
- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
- Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
- Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
- Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
- Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
- Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C. Fungal plasma membrane domains. FEMS Microbiology Reviews. , (2019).
- Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
- Bayram, &. #. 2. 1. 4. ;., Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
- Yu, J. -. H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
- Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
- Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
- Kasprowicz, R., Suman, R., O’Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
- Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
- Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
- Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
- Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).
- Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
- Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
- Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494 (2020).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, 2040-2048 (2009).
- Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).
- Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
- Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
- Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
- Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
- Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).
- Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -. H. Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
- Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
- Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).
