Vi præsenterer en etiketfri live imaging protokol ved hjælp af transmitterede lysmikroskopi teknikker til at fange billeder, analysere og kvantificere vækst kinetik af filamentous svamp A. nidulans i både nedsænket kulturer og faste medier. Denne protokol kan bruges sammen med fluorescensmikroskopi.
Det er veletableret, at koloni vækst af filamentøse svampe, for det meste afhængig af ændringer i hyphae / mycelia apikale vækstrate, er makroskopisk anslået på størknede medier ved at sammenligne koloni størrelse. Det er imidlertid en udfordring kvantitativt at måle vækstraten for genetisk forskellige svampestammer eller -stammer under forskellige miljø-/vækstbetingelser (pH, temperatur, kulstof- og kvælstofkilder, antibiotika osv.). Således bliver forfølgelsen af komplementære tilgange til kvantificering af vækst kinetiker obligatorisk for bedre at forstå svampecellevækst. Desuden er det velkendt, at filamentøse svampe, herunder Aspergillus spp., har forskellige former for vækst og differentiering under sub-antenne betingelser på solide medier eller nedsænket kulturer. Her beskriver vi en kvantitativ mikroskopisk metode til analyse af vækstkinetik af modelsvampen Aspergillus nidulans, ved hjælp af levende billeddannelse i både nedsænkede kulturer og solide medier. Vi tager billeder, analyserer og kvantificerer vækstrater for forskellige svampestammer på en reproducerbar og pålidelig måde ved hjælp af en open source, gratis software til biobilleder (f.eks. Fiji), på en måde, der ikke kræver nogen forudgående billedanalyseekspertise fra brugeren.
Filamentøse svampe er af stor socioøkonomisk og økologisk betydning, idet de begge er afgørende som industrielle / landbrugsmæssige værktøjer til enzym- og antibiotikaproduktion1,2 og som patogener af afgrødeplanter3,skadedyrsinsekter4 og mennesker3. Desuden er filamentøse svampe som Aspergillus nidulans meget udbredt som modelorganismer til grundforskning, såsom undersøgelser i genetik, celle- og evolutionær biologi samt til undersøgelse af hyphalforlængelse5. Filamentøse svampe er stærkt polariserede organismer, der forlænger gennem kontinuerlig forsyning af membran lipider / proteiner og de novo syntese af cellevæg ved den forlængende spids6. En central rolle i hyphal tip vækst og polaritet vedligeholdelse er en specialiseret struktur ved navn ‘Spitzenkorper’ (SPK), en højt bestilt struktur, der hovedsagelig består af cytoskeletale komponenter og polariseret distribution af Golgi6,7,8.
Miljømæssige stimuli / signaler, sådan vand-luft interface, lys, CO2 koncentration, og den ernæringsmæssige status er ansvarlige for de udviklingsmæssige beslutninger truffet af disse forme9. I nedsænkede (flydende) kulturer er differentiering af A. nidulans undertrykt, og væksten opstår ved hyphal tip elongation6. Under vegetativ vækst spirer aseksuel sporer (conidia) ved apikal udvidelse og danner et udifferentieret netværk af indbyrdes forbundne hyphalceller, myceliet, som kan fortsætte med at vokse på ubestemt tid, så længe næringsstoffer og plads er tilgængelige. På den anden side, på solide medier hyphal tips forlænge og efter en defineret periode med vegetativ vækst (udviklingskompetence), aseksuel reproduktion er indledt og antenne conidiophore stilke strækker sig fra specialiserede fodceller i mycelium6. Disse giver anledning til specialiserede udviklingsmæssige flercellede strukturer kaldet conidiophores, som producerer lange kæder af haploid conidia10, der kan genstarte væksten under gunstige miljøforhold.
En udbredt metode til måling af filamentøs svampevækst er at vaccinere sporer på næringsstof agar indeholdt i en petriskål og makroskopisk måle diameteren af kolonien et par dage senere11. Diameteren / området af kolonien, mest afhængig af ændringer i mycelial vækstrate og mindre på conidiophore tæthed12, bruges derefter som en værdi af vækst. Selvom måling af svampepopulationens (koloni) størrelse, der vokser på faste overflader, er helt tilstrækkelig, er det på ingen måde det mest nøjagtige mål for vækst. Sammenlignet med befolkningsgennemsnit (gennemsnit af svampekolonistørrelse) kan målinger af en enkelt celle fange en cellepopulations heterogenitet og gøre det muligt at identificere nye underpopulationer af celler, stater13, dynamik, veje samt de biologiske mekanismer, hvormed celler reagerer på endogene og miljømæssige ændringer14,15. Overvågning svampe cellevækst og fænotype ved time-lapse mikroskopi er velsagtens den mest udbredte kvantitative enkelt celle observation tilgang.
Heri beskriver vi en etiketfri live imaging protokol ved hjælp af transmitterede lysmikroskopiteknikker (såsom fasekontrast, differentialinterferenskontrast (DIC) og polariseret mikroskopi) for at fange billeder, som uafhængigt af den kombinerede brug af fluorescensmikroskopi kan anvendes til at analysere og kvantificere polarvæksten af A. nidulansstammer i både nedsænkede kulturer og faste medier.
Overvågning svampecellevækst og fænotype ved time-lapse mikroskopi er en kraftfuld tilgang til at vurdere cellulære adfærd i realtid og kvantitativt og præcist afgøre, om en bestemt lægemiddelbehandling og / eller genetisk intervention resulterer i påviselig cellevækst eller fænotypiske forskelle over tid.
I denne undersøgelse blev en pålidelig live-celle billeddannelsesmetode beskrevet til at måle og kvantitativt analysere svampeudvikling, herunder dynamikken i kimrør og hyphal…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist støttet af projektet “En græsk forskningsinfrastruktur til visualisering og overvågning af grundlæggende biologiske processer (BioImaging-GR)” (MIS 5002755), som gennemføres under aktionen “Styrkelse af forsknings- og innovationsinfrastrukturen”, finansieret af det operationelle program “Konkurrenceevne, iværksætteri og innovation” (NSRF 2014-2020) og medfinansieret af Grækenland og EU.
µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
Biotin | Merck | B4639 | |
Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
Glucose | Merck | G8270 | |
GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
Peptone | Millipore | 68971 | |
Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
Potassium chloride | Merck | P4504 | |
Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
Quali – Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
Quali – Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
Quali – Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
Quali – Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
Sodium chloride | Merck | S7653 | |
Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
ZnSO4 |