Analisi quantitativa del tasso di crescita di Aspergillus nidulans utilizzando la microscopia dal vivo e il software open source
Summary
Presentiamo un protocollo di imaging live senza etichette che utilizza tecniche di microscopia ottica trasmessa per catturare immagini, analizzare e quantificare la cinetica di crescita del fungo filamentoso A. nidulans sia in colture sommerse che in mezzi solidi. Questo protocollo può essere utilizzato in combinazione con la microscopia a fluorescenza.
Abstract
È ben noto che la crescita delle colonie di funghi filamentosi, per lo più dipendente dai cambiamenti nel tasso di crescita apicale di ife/micelio, è stimata macroscopicamente su mezzi solidificati confrontando le dimensioni della colonia. Tuttavia, misurare quantitativamente il tasso di crescita di ceppi o ceppi fungini geneticamente diversi in diverse condizioni ambientali / di crescita (pH, temperatura, fonti di carbonio e azoto, antibiotici, ecc.) è impegnativo. Pertanto, la ricerca di approcci complementari per quantificare la cinetica di crescita diventa obbligatoria al fine di comprendere meglio la crescita delle cellule fungine. Inoltre, è ben noto che i funghi filamentosi, tra cui Aspergillus spp., hanno modalità distinte di crescita e differenziazione in condizioni sub-aeree su mezzi solidi o colture sommerse. Qui, descriviamo in dettaglio un metodo microscopico quantitativo per analizzare la cinetica di crescita del fungo modello Aspergillus nidulans, utilizzando l’imaging dal vivo sia in colture sommerse che in mezzi solidi. Catturiamo immagini, analizziamo e quantifichiamo i tassi di crescita di diversi ceppi fungini in modo riproducibile e affidabile utilizzando un software gratuito open source per bio-immagini (ad esempio, Fiji), in un modo che non richiede alcuna precedente esperienza di analisi delle immagini da parte dell’utente.
Introduction
I funghi filamentosi sono di grande importanza socioeconomica ed ecologica, essendo sia cruciali come strumenti industriali / agricoli per la produzione di enzimi e antibiotici1,2 e come agenti patogeni delle piante coltivate3,insetti parassiti4 e umani3. Inoltre, i funghi filamentosi come Aspergillus nidulans sono ampiamente utilizzati come organismi modello per la ricerca fondamentale, come studi in genetica, biologia cellulare ed evolutiva, nonché per lo studio dell’estensione ifale5. I funghi filamentosi sono organismi altamente polarizzati che si allungano attraverso l’apporto continuo di lipidi/proteine di membrana e la sintesi de novo della parete cellulare alla punta estensente6. Un ruolo centrale nella crescita della punta ifale e nel mantenimento della polarità è una struttura specializzata chiamata ‘Spitzenkorper’ (SPK), una struttura altamente ordinata costituita principalmente da componenti citoscheletriche e dalla distribuzione polarizzata del Golgi6,7,8.
Stimoli /segnali ambientali, come l’interfaccia acqua-aria, la luce, la concentrazione di CO2 e lo stato nutrizionale sono responsabili delle decisioni di sviluppo prese da queste muffe9. Nelle colture sommerse (liquide) la differenziazione di A. nidulans è repressa e la crescita avviene per allungamento della punta ifale6. Durante la crescita vegetativa, le spore asessuate (conidi) germinano per estensione apicale, formando una rete indifferenziata di cellule ifali interconnesse, il micelio, che può continuare a crescere indefinitamente finché i nutrienti e lo spazio sono disponibili. D’altra parte, sui mezzi solidi le punte ifali si allungano e dopo un periodo definito di crescita vegetativa (competenza evolutiva), viene avviata la riproduzione asessuata e i gambi conidiofori aerei si estendono da cellule del piede specializzate del micelio6. Questi danno origine a strutture multicellulari di sviluppo specializzate chiamate conidiofori, che producono lunghe catene di conidiaploidi 10 che possono riavviare la crescita in condizioni ambientali favorevoli.
Un metodo ampiamente utilizzato per misurare la crescita fungina filamentosa è quello di inoculare le spore sull’agar nutriente contenuto in una capsula di Petri e misurare macroscopicamente il diametro della colonia pochi giorni dopo11. Il diametro/area della colonia, più dipendente dalle variazioni del tasso di crescita miceliale e meno dalla densità conidioforica12,viene quindi utilizzato come valore di crescita. Sebbene la misurazione delle dimensioni della popolazione fungina (colonia) che cresce su superfici solide sia abbastanza adeguata, non è affatto la misura più accurata della crescita. Rispetto alle medie del livello di popolazione (medie delle dimensioni delle colonie fungine), le misurazioni delle singole cellule possono catturare l’eterogeneità di una popolazione cellulare e consentire l’identificazione di nuove sotto-popolazioni di cellule, stati13, dinamiche,percorsi e i meccanismi biologici con cui le cellule rispondono ai cambiamenti endogeni e ambientali14,15. Il monitoraggio della crescita e del fenotipo delle cellule fungine mediante microscopia time-lapse è probabilmente l’approccio quantitativo di osservazione a singola cellula più ampiamente utilizzato.
Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo di imaging dal vivo privo di etichette che utilizza tecniche di microscopia ottica trasmessa (come contrasto di fase, contrasto di interferenza differenziale (DIC) e microscopia polarizzata) per acquisire immagini, che indipendentemente dall’uso combinato della microscopia a fluorescenza possono essere utilizzate per analizzare e quantificare la crescita polare dei ceppi di A. nidulans sia in colture sommerse che in mezzi solidi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il monitoraggio della crescita e del fenotipo delle cellule fungine mediante microscopia time-lapse è un approccio potente per valutare il comportamento cellulare in tempo reale e quantitativamente e determinare con precisione se un particolare trattamento farmacologico e / o intervento genetico si traduce in una crescita cellulare rilevabile o differenze fenotipiche nel tempo.
In questo studio, è stata descritta una metodologia affidabile di imaging a cellule vive per misurare e analizzare …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato in parte sostenuto dal progetto “A Greek Research Infrastructure for Visualizing and Monitoring Fundamental Biological Processes (BioImaging-GR)” (MIS 5002755) che è implementato nell’ambito dell’azione “Rafforzamento dell’infrastruttura di ricerca e innovazione”, finanziato dal programma operativo “Competitività, imprenditorialità e innovazione” (NSRF 2014-2020) e cofinanziato dalla Grecia e dall’UE.
Materials
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
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