Количественный анализ скорости роста Aspergillus nidulans с использованием живой микроскопии и программного обеспечения с открытым исходным кодом
Summary
Мы представляем протокол визуализации в реальном времени без меток, использующий методы микроскопии пропускаемого света для захвата изображений, анализа и количественной оценки кинетики роста нитевидного гриба A. nidulans как в погруженных культурах, так и в твердых средах. Этот протокол может использоваться в сочетании с флуоресцентной микроскопией.
Abstract
Хорошо известно, что рост колонии нитевидных грибов, в основном зависящий от изменений скорости роста гиф/мицелия, макроскопически оценивается на затверделых средах путем сравнения размеров колоний. Однако количественно измерить скорость роста генетически различных грибковых штаммов или штаммов в различных условиях окружающей среды / роста (рН, температура, источники углерода и азота, антибиотики и т. Д.) Является сложной задачей. Таким образом, стремление к комплементарным подходам к количественной оценке кинетики роста становится обязательным, чтобы лучше понять рост грибковых клеток. Кроме того, хорошо известно, что нитевидные грибы, включая Aspergillus spp., имеют различные способы роста и дифференциации в субвоздушных условиях на твердых средах или погруженных культурах. Здесь мы подробно описываем количественный микроскопический метод анализа кинетики роста модельного гриба Aspergillus nidulans,используя живую визуализацию как в погруженных культурах, так и в твердых средах. Мы захватываем изображения, анализируем и количественно определяем темпы роста различных штаммов грибов воспроизводимым и надежным способом, используя бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом для биоизобликов (например, Фиджи), таким образом, чтобы не требовал от пользователя какого-либо предварительного опыта анализа изображений.
Introduction
Нитевидные грибы имеют большое социально-экономическое и экологическое значение, будучи как промышленными/сельскохозяйственными инструментами для производства ферментов иантибиотиков 1,2, так и патогенами сельскохозяйственных растений3,насекомых-вредителей4 и человека3. Кроме того, нитевидные грибы, такие как Aspergillus nidulans, широко используются в качестве модельных организмов для фундаментальных исследований, таких как исследования в области генетики, клеточной и эволюционной биологии, а также для изучения гифального расширения5. Нитевидные грибы представляют собой высокополяризованные организмы, которые удлиняются за счет непрерывного снабжения мембранных липидов/белков и de novo синтеза клеточной стенки на расширяющейся кончике6. Центральную роль в росте и поддержании полярности гифального кончика играет специализированная структура под названием «Шпитценкорпер» (SPK), высокоупорядоченная структура, состоящая в основном из цитоскелетных компонентов и поляризованного распределения Гольджи6,7,8.
Стимулы/сигналы окружающей среды, такие как водно-воздушный интерфейс, свет, концентрация CO2 и состояние питания, отвечают за решения развития, принимаемые этими формами9. В погруженных (жидких) культурах дифференциация A. nidulans подавляется и рост происходит путем удлинения гифального кончика6. Во время вегетативного роста беспощадные споры (конидии) прорастают апикальным расширением, образуя недифференцированную сеть взаимосвязанных гифальных клеток, мицелий, который может продолжать расти бесконечно, пока доступны питательные вещества и пространство. С другой стороны, на твердых носителях гифальные кончики удлиняются и после определенного периода вегетативного роста (развития компетентности) инициируется бесполое размножение и воздушные конидиофорные стебли простираются от специализированных клеток стопы мицелия6. Они порождают специализированные многоклеточные структуры развития, называемые конидиофорами, которые производят длинные цепи гаплоидных конидий10, которые могут возобновить рост при благоприятных условиях окружающей среды.
Широко используемым методом измерения роста нитевидных грибов является инокуляция спор на питательный агар, содержащийся в чашке Петри, и макроскопическое измерение диаметра колонии через несколькодней 11. Диаметр/площадь колонии, наиболее зависящая от изменений скорости роста мицелиала и меньше от плотности конидиофора12,затем используется в качестве значения роста. Хотя измерение размера грибковой популяции (колонии), растущей на твердых поверхностях, вполне адекватно, это ни в коем случае не самая точная мера роста. По сравнению со средними показателями популяционного уровня (средними значениями размера грибковой колонии), измерения одной клетки могут фиксировать гетерогенность клеточной популяции и позволяют идентифицировать новые субпопудрения клеток, состояния13,динамику, пути, а также биологические механизмы, с помощью которых клетки реагируют на эндогенные и экологические изменения14,15. Мониторинг роста и фенотипа грибковых клеток с помощью покадровой микроскопии, возможно, является наиболее широко используемым количественным подходом к наблюдению за одной клеткой.
Здесь мы подробно описываем протокол визуализации в реальном времени без меток с использованием методов микроскопии пропускаемого света (таких как фазовый контраст, дифференциальный интерференционный контраст (DIC) и поляризованная микроскопия) для захвата изображений, которые независимо от совместного использования флуоресцентной микроскопии могут быть использованы для анализа и количественной оценки полярного роста штаммов A. nidulans как в погруженных культурах, так и в твердых средах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мониторинг роста и фенотипа грибковых клеток с помощью покадровой микроскопии является мощным подходом к оценке клеточного поведения в режиме реального времени и количественно и точно определить, приводит ли конкретное лекарственное лечение и / или генетическое вмешательство к обна?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана проектом «Греческая исследовательская инфраструктура для визуализации и мониторинга фундаментальных биологических процессов (BioImaging-GR)» (MIS 5002755), который реализуется в рамках акции «Укрепление научно-исследовательской и инновационной инфраструктуры», финансируемой Оперативной программой «Конкурентоспособность, предпринимательство и инновации» (NSRF 2014-2020) и софинансируемой Грецией и ЕС.
Materials
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
References
- Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).
- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
- Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
- Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
- Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
- Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
- Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C. Fungal plasma membrane domains. FEMS Microbiology Reviews. , (2019).
- Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
- Bayram, &. #. 2. 1. 4. ;., Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
- Yu, J. -. H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
- Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
- Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
- Kasprowicz, R., Suman, R., O’Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
- Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
- Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
- Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
- Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).
- Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
- Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
- Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494 (2020).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, 2040-2048 (2009).
- Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).
- Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
- Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
- Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
- Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
- Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).
- Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -. H. Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
- Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
- Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).
