Análisis cuantitativo de la tasa de crecimiento de Aspergillus nidulans utilizando microscopía en vivo y software de código abierto
Summary
Presentamos un protocolo de imágenes en vivo sin etiquetas que utiliza técnicas de microscopía de luz transmitida para capturar imágenes, analizar y cuantificar la cinética de crecimiento del hongo filamentoso A. nidulans tanto en cultivos sumergidos como en medios sólidos. Este protocolo se puede utilizar junto con la microscopía de fluorescencia.
Abstract
Está bien establecido que el crecimiento de colonias de hongos filamentosos, en su mayoría dependiente de cambios en la tasa de crecimiento apical de hifas/micelios, se estima macroscópicamente en medios solidificados comparando el tamaño de la colonia. Sin embargo, medir cuantitativamente la tasa de crecimiento de cepas o cepas de hongos genéticamente diferentes bajo diferentes condiciones ambientales / de crecimiento (pH, temperatura, fuentes de carbono y nitrógeno, antibióticos, etc.) es un desafío. Por lo tanto, la búsqueda de enfoques complementarios para cuantificar la cinética del crecimiento se vuelve obligatoria para comprender mejor el crecimiento de células fúngicas. Además, es bien sabido que los hongos filamentosos, incluido Aspergillus spp., tienen distintos modos de crecimiento y diferenciación en condiciones subaésperas en medios sólidos o cultivos sumergidos. Aquí, detallamos un método microscópico cuantitativo para analizar la cinética de crecimiento del hongo modelo Aspergillus nidulans,utilizando imágenes en vivo tanto en cultivos sumergidos como en medios sólidos. Capturamos imágenes, analizamos y cuantificamos las tasas de crecimiento de diferentes cepas de hongos de una manera reproducible y confiable utilizando un software libre de código abierto para bio-imágenes (por ejemplo, Fiji), de una manera que no requiere ninguna experiencia previa en análisis de imágenes por parte del usuario.
Introduction
Los hongos filamentosos son de gran importancia socioeconómica y ecológica, siendo tanto cruciales como herramientas industriales/agrícolas para la producción de enzimas y antibióticos1,2 y como patógenos de plantas de cultivo3,insectos plaga4 y humanos3. Además, los hongos filamentosos como Aspergillus nidulans son ampliamente utilizados como organismos modelo para la investigación fundamental, como los estudios en genética, biología celular y evolutiva, así como para el estudio de la extensión hifal5. Los hongos filamentosos son organismos altamente polarizados que se alargan a través del suministro continuo de lípidos/proteínas de membrana y la síntesis de novo de la pared celular en la punta extensible6. Un papel central en el crecimiento de la punta hifal y el mantenimiento de la polaridad es una estructura especializada llamada ‘Spitzenkorper’ (SPK), una estructura altamente ordenada que consiste principalmente en componentes citoesqueléticos y la distribución polarizada de los6,7,8de Golgi.
Los estímulos/señales ambientales, como la interfaz agua-aire, la luz, la concentración de CO2 y el estado nutricional son responsables de las decisiones de desarrollo tomadas por estos mohos9. En cultivos sumergidos (líquidos) se reprime la diferenciación de A. nidulans y se produce el crecimiento por elongación de la punta hifal6. Durante el crecimiento vegetativo, las esporas asexuales (conidios) germinan por extensión apical, formando una red indiferenciada de células hifales interconectadas, el micelio, que pueden continuar creciendo indefinidamente mientras los nutrientes y el espacio estén disponibles. Por otro lado, en las puntas hifales de medios sólidos alargadas y después de un período definido de crecimiento vegetativo (competencia del desarrollo), se inicia la reproducción asexual y los tallos de conidióforos aéreos se extienden desde las células especializadas del pie del micelio6. Estos dan lugar a estructuras multicelulares de desarrollo especializadas llamadas conidióforos, que producen largas cadenas de conidios haploides10 que pueden reiniciar el crecimiento en condiciones ambientales favorables.
Un método ampliamente utilizado para medir el crecimiento de hongos filamentosos es inocular esporas en agar nutriente contenido en una placa de Petri y medir macroscópicamente el diámetro de la colonia unos días después11. El diámetro/área de la colonia, más dependiente de los cambios en la tasa de crecimiento micelial y menos de la densidad del conidióforo12,se utiliza entonces como valor de crecimiento. Aunque, medir el tamaño de la población fúngica (colonia) que crece en superficies sólidas es bastante adecuado, de ninguna manera es la medida más precisa del crecimiento. En comparación con los promedios a nivel poblacional (promedios del tamaño de las colonias de hongos), las mediciones de una sola célula pueden capturar la heterogeneidad de una población celular y permitir la identificación de nuevas subpoblaciones de células, estados13,dinámicas, vías, así como los mecanismos biológicos por los cuales las células responden a los cambios endógenos y ambientales14,15. El monitoreo del crecimiento y fenotipo de células fúngicas por microscopía de lapso de tiempo es posiblemente el enfoque cuantitativo de observación de células individuales más ampliamente empleado.
A continuación, detallamos un protocolo de imágenes en vivo sin etiquetas que utiliza técnicas de microscopía de luz transmitida (como contraste de fase, contraste de interferencia diferencial (DIC) y microscopía polarizada) para capturar imágenes, que independientemente del uso combinado de microscopía de fluorescencia se puede emplear para analizar y cuantificar el crecimiento polar de cepas de A. nidulans tanto en cultivos sumergidos como en medios sólidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El monitoreo del crecimiento y fenotipo de células fúngicas por microscopía de lapso de tiempo es un enfoque poderoso para evaluar el comportamiento celular en tiempo real y determinar cuantitativa y precisamente si un tratamiento farmacológico en particular y / o intervención genética da como resultado un crecimiento celular detectable o diferencias fenotípicas a lo largo del tiempo.
En este estudio, se describió una metodología confiable de imágenes de células vivas para medir y a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por el proyecto “A Greek Research Infrastructure for Visualizing and Monitoring Fundamental Biological Processes (BioImaging-GR)” (MIS 5002755) que se implementa en el marco de la Acción “Refuerzo de la Infraestructura de Investigación e Innovación”, financiado por el Programa Operativo “Competitividad, Emprendimiento e Innovación” (NSRF 2014-2020) y cofinanciado por Grecia y la UE.
Materials
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
References
- Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).
- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
- Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
- Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
- Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
- Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
- Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C. Fungal plasma membrane domains. FEMS Microbiology Reviews. , (2019).
- Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
- Bayram, &. #. 2. 1. 4. ;., Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
- Yu, J. -. H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
- Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
- Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
- Kasprowicz, R., Suman, R., O’Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
- Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
- Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
- Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
- Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).
- Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
- Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
- Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494 (2020).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, 2040-2048 (2009).
- Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).
- Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
- Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
- Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
- Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
- Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).
- Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -. H. Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
- Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
- Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).
