Summary

연골 내의 마이그레이션 및 섭취 모니터링을 위한 세포외 소포 라벨링

Published: October 04, 2021
doi:

Summary

여기에서, 우리는 골관절염을 위한 모형으로 이용된 연골 이병 에서 그들의 이동 그리고 upup를 감시하기 위하여 혈소판 lysate 유래 세포외 소포를 레이블을 붙이는 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

세포 외 소포 (EV)는 혈소판 용해 (PL)와 같은 세포 공급원에서 파생 된 화물로 인해 세포없는 치료로서의 잠재력을 증명하기 위해 다른 연구에서 사용됩니다. 치료로 사용되는 경우, EV는 표적 세포를 입력하고 이들로부터의 반응에 영향을 미칠 것으로 예상된다. 이 연구에서, PL 유래 전기 는 골관절염에 대 한 세포 없는 치료로 공부 되었습니다 (OA). 따라서, 방법은 EV를 라벨과 연골 각질에 대한 그들의 섭취량을 테스트하도록 설정되었다. PL 유래 전기는 리포마이트 염료 PKH26로 표지되고, 컬럼을 통해 두 번 세척한 다음, 나노입자 추적 분석(NTA)에 의한 입자 정량화 후 5h에 대한 체외 염증 중심OA 모델에서 테스트한다. 시간당 연골 이출은 고정되고, 파라플료로 절단되어 6 μm 섹션으로 절단되어 슬라이드에 장착하고, 공초점 현미경으로 관찰됩니다. 이를 통해 이 기간 동안 EV가 대상 셀(연골세포)에 진입하는지 여부를 검증하고 직접적인 효과를 분석할 수 있습니다.

Introduction

골관절염(OA)은 관절 연골1의세포외 매트릭스의 점진적이고 돌이킬 수 없는 염증 및 파괴를 의미하는 관절 퇴행성 질환이다. 관절염의 다양한 형태는 수많은 치료를 가지고 있지만2,3,4,이들은 자신의 부작용과 제한된 효능에 의해 제한됩니다. 자가 연골성 이식을 이용한 조직 공학 기술은 조기 OA 연골 병변4에서부상당한 연골의 재생 치료를 위해 일상적으로 적용된다. 세포 기반 치료법은 주로 연골3을효과적으로 수리할 수 있는 페노전형안정연골세포 또는 연골로겐이터의 수가 제한되어 있기 때문에 제한된다. 따라서 질병 진행을 방지하고 큰 연골 병변을 재생하는 새로운 치료 전략의 개발이 가장 중요합니다.

세포 외 소포 (EV)는 다른저자에의해 OA에 대한 치료로 제안되었습니다5,6. 전기자동차는 대부분의 세포 유형에 의해 분비되는 암골체이며, 세포간 신호에 관여하며, 줄기세포의 치료 효과를 발휘하는 것으로 나타났으며,8,9,최근재생의학에대한 관심을 유도하고 있다. 중간엽 기질 세포(MSC)에서 유래된 전기는 OA를 위해 조사되는 주요 치료 용 전기자동차이지만, 다른 관절 관련 세포는 EV 소스, 예를 들어, 촌드롭로겐이터 또는 면역세포(11,12)로사용되어 왔다.

혈소판 용액(PLs)과 같은 혈소판 농축물들은 각막궤양(13,14,15) 또는 힘줄 조직 재생16과같은 상이한 부상에서 상처 치유를 향상시키는 데 사용되며, 혈소판 농축물의 EV 성분이 이러한 효과에 대한 책임이 있을 수 있다는 가설 로 인해17 . 관절 관련 질환과 관련된 일부 연구는 혈소판 유래 EV (PL-EV)를 관절 관절염 조건에 대한 치료로 사용합니다. PL-Ev는 Wnt/β-카테닌통로(18)를활성화하여 연골세포 증식 및 세포 이동을 개선, 골관절염분골19에서연골성 마커의 발현을 촉진하거나, 더 높은 수준의 연골관절염 단백질을 나타내거나, PL-E18로 치료된 골관절염 토끼의 더 적은 치창 이상을 보여준다.

전기자동차는 표적 세포로 해방되는 단백질, 지질 및 핵산을 함유하고 있으며, 세포 간 통신을 확립하여 치료 적용20과관련된 주요 특징이다. EV의 효과는 도달 셀과 후속 화물 방출에 따라 달라집니다. 이러한 효과는 대사 활동 또는 유전자 발현 수정과 같은 세포에 의한 변화에 의해 간접적으로 확인할 수 있다. 그러나 이러한 방법은 EV가 세포에 도달하는 방법을 시각화하여 기능을 발휘하도록 허용하지 않습니다. 따라서, 본 논문은 염증 중심의 OA 연골 연골 경질 에 대한 치료제로 사용되는 이러한 PL 유래 전기자동차를 라벨링하는 방법을 제시한다. 공초점 현미경 검사는 5h의 시간 경과에 있는 소멸에 존재하는 연골세포에 EV uptake 및 진행을 감시하기 위하여 이용되었습니다.

Protocol

참고: 이디스바 바이오뱅크(IB 1995/12 BIO)로부터 CEI-IB(IB 3656118 PI)의 프로젝트의 윤리적 승인 후 제도적 가이드라인에 따라 연골 이출을 획득했습니다. 1. 열 준비 제조업체의 지침에 따라 또는 다음과 같이 열을 평형화합니다. 열 캡을 제거하고 열을 상위화합니다. 용출하여 저장소 버퍼를 제거합니다. 인산염 완충식식염(PBS)의 2.5mL로 컬럼을 3회 세척한다. ?…

Representative Results

도 1에EV 라벨링 및 업테이크 모니터링에 대한 회로도 개요가 표시됩니다. 표 1에서 NTA에 의해 검출된 입자 농도 및 EV 크기는 컬럼으로 라벨링한 후 두 번 수행된 정화 단계로 인해 공정 중에 EV 농도가 감소함을 보여준다. 그러나, 얻어진 양은 처리를 위해 사용하는 입자의 수의 최적 범위에 있다. 이러한 입자 농도는 골관절염 연골 경질을 치료하는 데 사용되는 P…

Discussion

EV 이미징은 방출 및 섭취 메커니즘과 같은 EV 특성을 이해하는 데 도움이 됩니다. 그들의 화상 진찰은 그들의 생체 분배의 감시 및 약동성 속성의 특성을 약 차량으로 허용합니다. 그러나, EV 이미징 및 추적은 그들의 작은 크기 때문에 어려울 수 있습니다, 많은 이미징 장치 및 라벨링 기술은 연구원이 체외및 생체 내 조건에서 전기를 모니터링하는 데 도움이 개발되었지만<sup class="xre…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 INstituto 드 살루드 카를로스 III, 장관 드 Economía y Competitividad에 의해 투자되었다, ESF 유럽 사회 기금과 ERDF 유럽 지역 개발 기금에 의해 공동 투자 (MS16/00124; CP16/00124); PROGRAMA 주니어 델 프로이토 탤런트 플러스, construyendo SALUD, 제네란도 VALOR (JUNIOR01/18), 발레 아레스 제도의 지속 가능한 관광 세금에 의해 자금; 디레치오 장군 디Investigació, 콘셀러디아 d’Investigació, 지배 발레아 (FPI/2046/2017); FUTURMed 내에서 FOLIUM 박사 후 프로그램 (FOLIUM 17/01)에 의해, 발레 아레스 제도의 지속 가능한 관광 세금에 의해 50 %와 ESF에 의해 50 %로 자금; 그리고 코미시오 데 도센시아 i Investigacio 데 라 Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).

Materials

Material
1.5 mL Centrifuge tube SPL life sciences PLC60015
1 mL Syringe BD Plastipak BD 303174
2-Propanol (Isopropanol) Panreac AppliChem 1.310.901.211 Prepared at 20% with Milli-Q water
96-well culture plate SPL life sciences PLC30096
Absolute ethanol Pharmpur Scharlab ET0006005P Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water
Biopsy Punch with plunger 3 mm Scandidact MTP-33-32
Bovine serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 Prepared at 5% with PBS
Cartilage explants IdISBa Biobank
Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega Pall MCP100C41
Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega Pall OD003C33
Cover glass 24 x 60 mm Deltalab D102460
DMEM-F12 -GlutaMAX medium Biowest L0092
Dulbecco's PBS (1x) Capricorn Scientific PBS-1A
Embedded paraffin tissue blocks IdISBa Biobank Fee for service
Exo-spin mini-HD columns Cell guidance systems EX05
Feather S35 Microtome Blade Feather 43037
Filtropur S 0.2 µm syringe filter Sarstedt 83.1826.001
Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F-6057
Oncostatin M Human Sigma-Aldrich O9635-10UG Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 8.18715.1000 Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C
Penicillin-Streptomycin Solution 100x Biowest L0022
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling Sigma-Aldrich MINI26 PKH26 and Dliuent C included
Sodium citrate dihydrate Scharlab SO019911000
Superfrost Plus Microscope Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
TNFα R&D systems 210-TA-005 Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water
Xylene Scharlab XI0050005P
Equipment
Centrifuge 5430 R Eppendorf 5428000210 F-45-48-11 rotor
NanoSight NS300 Malvern NS300 Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS
Shandon Finesse 325 Manual Microtome Thermo Scientific™ A78100101
TCS-SPE confocal microscope Leica Microsystems 5200000271

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Citer Cet Article
Forteza-Genestra, M. A., Antich-Rosselló, M., Ortega, F. G., Ramis-Munar, G., Calvo, J., Gayà, A., Monjo, M., Ramis, J. M. Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants. J. Vis. Exp. (176), e62780, doi:10.3791/62780 (2021).

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