Marquage des vésicules extracellulaires pour surveiller la migration et l’absorption dans les explants cartilagineux
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour marquer les vésicules extracellulaires dérivées du lysat plaquettaire afin de surveiller leur migration et leur absorption dans les explants cartilagineux utilisés comme modèle pour l’arthrose.
Abstract
Les vésicules extracellulaires (VE) sont utilisées dans différentes études pour prouver leur potentiel en tant que traitement sans cellules en raison de leur cargaison dérivée de leur source cellulaire, comme le lysat plaquettaire (PL). Lorsqu’ils sont utilisés comme traitement, on s’attend à ce que les VE pénètrent dans les cellules cibles et y répondent. Dans cette recherche, les VE dérivés de PL ont été étudiés comme traitement sans cellules pour l’arthrose (OA). Ainsi, une méthode a été mise en place pour étiqueter les VE et tester leur absorption sur les explants cartilagineux. Les VE dérivés de PL sont marqués avec le colorant lipophile PKH26, lavés deux fois à travers une colonne, puis testés dans un modèle d’arthrose in vitro induit par l’inflammation pendant 5 h après quantification des particules par analyse de suivi des nanoparticules (NTA). Toutes les heures, les explants de cartilage sont fixés, paraffinés, coupés en sections de 6 μm pour être montés sur des lames et observés au microscope confocal. Cela permet de vérifier si les VE pénètrent dans les cellules cibles (chondrocytes) pendant cette période et d’analyser leur effet direct.
Introduction
L’arthrose (OA) est une maladie dégénérative articulaire qui implique une inflammation progressive et irréversible et la destruction de la matrice extracellulaire du cartilage articulaire1. Bien que diverses formes d’arthrite aient de nombreux traitements2,3,4, ceux-ci sont limités par leurs effets secondaires et leur efficacité limitée. Les techniques d’ingénierie tissulaire utilisant l’implantation de chondrocytes autologues sont couramment appliquées pour le traitement régénératif du cartilage blessé dans les lésions cartilagineuses précocesde l’arthrose 4. Les thérapies cellulaires sont limitées principalement en raison du nombre limité de chondrocytes phénotypiquement stables ou de chondroprogenitors capables de réparer efficacement le cartilage3. Par conséquent, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir la progression de la maladie et régénérer les grandes lésions cartilagineuses est d’une importance capitale.
Les vésicules extracellulaires (VE) ont été suggérées comme traitement de l’arthrose par différents auteurs5,6. Les VE sont des corps membraneux sécrétés par la majorité des types de cellules, sont impliqués dans la signalisation intercellulaire et il a été démontré qu’ils exercent les effets thérapeutiques des cellules souches7,8,9, en raison desquels ils ont récemment suscité un intérêt pour la médecine régénérative10. Les VE dérivés de cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont les principaux VE thérapeutiques étudiés pour l’arthrose, bien que d’autres cellules liées aux articulations aient été utilisées comme sources de VE, par exemple, les chondroprogeniteurs ou les cellules immunitaires11,12.
Les concentrés de plaquettes, tels que les lysats plaquettaires (PL), sont utilisés pour améliorer la cicatrisation des plaies dans différentes blessures, telles que les ulcères cornéens13,14,15 ou dans la régénération du tissu tendineux16, en raison de l’hypothèse que le composant EV des concentrés plaquettaires peut être responsable de ces effets17 . Certaines études liées aux maladies articulaires utilisent des VE d’origine plaquettaire (PL-VE) comme traitement pour améliorer les conditions arthrosiques. Les PL-EV améliorent la prolifération des chondrocytes et la migration cellulaire en activant la voie Wnt/β-caténine18,favorisant l’expression de marqueurs chondrogènes dans les chondrocytes arthrosiques19,ou montrant des niveaux plus élevés de protéines chondrogènes et moins d’anomalies tissulaires chez les lapins arthrosiques traités par PL-VE18.
Les VE contiennent des protéines, des lipides et des acides nucléiques qui sont libérés dans la cellule cible, établissant une communication de cellule à cellule, qui est la principale caractéristique liée à leurs applications thérapeutiques20. Les effets des véhicules électriques dépendent de leurs cellules d’atteinte et du rejet ultérieur de la cargaison. Cet effet peut être confirmé indirectement par des changements causés dans les cellules, tels que l’activité métabolique ou la modification de l’expression des gènes. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de visualiser comment les VE atteignent les cellules pour exercer leur fonction. Ainsi, cet article présente une méthode pour étiqueter ces VE dérivés de PL à utiliser comme traitement pour les explants de cartilage OA induits par l’inflammation. La microscopie confocale a été utilisée pour surveiller l’absorption et la progression de la VE vers les chondrocytes présents dans les explants en un laps de temps de 5 h.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’imagerie des VE aide à comprendre les propriétés des VE, telles que leurs mécanismes de libération et d’absorption. Leur imagerie permet le suivi de leur biodistribution et la caractérisation de leurs propriétés pharmacocinétiques en tant que véhicules médicamenteux. Cependant, l’imagerie et le suivi des VE peuvent être difficiles en raison de leur petite taille, bien que de nombreux dispositifs d’imagerie et techniques d’étiquetage aient été développés pour aider les chercheurs à surveiller…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par l’Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, cofinancée par le Fonds social européen du FSE et le Fonds européen de développement régional du FEDER (MS16/00124; CP16/00124); par le PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financé par la taxe de tourisme durable des îles Baléares; par la Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); par le programme postdoctoral FOLIUM (FOLIUM 17/01) dans le cadre du FUTURMed, financé à 50% par la taxe de tourisme durable des îles Baléares et à 50% par le FSE; et par la Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).
Materials
| Material | |||
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1 mL Syringe BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | Prepared at 20% with Milli-Q water |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolute ethanol Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water |
| Biopsy Punch with plunger 3 mm | Scandidact | MTP-33-32 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Prepared at 5% with PBS |
| Cartilage explants | IdISBa Biobank | ||
| Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega | Pall | MCP100C41 | |
| Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega | Pall | OD003C33 | |
| Cover glass 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX medium | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Embedded paraffin tissue blocks | IdISBa Biobank | Fee for service | |
| Exo-spin mini-HD columns | Cell guidance systems | EX05 | |
| Feather S35 Microtome Blade | Feather | 43037 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| Oncostatin M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 and Dliuent C included |
| Sodium citrate dihydrate | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| TNFα | R&D systems | 210-TA-005 | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water |
| Xylene | Scharlab | XI0050005P | |
| Equipment | |||
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| NanoSight NS300 | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Shandon Finesse 325 Manual Microtome | Thermo Scientific™ | A78100101 | |
| TCS-SPE confocal microscope | Leica Microsystems | 5200000271 |
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