軟骨外植木における移動と取り込みモニタリングのための細胞外小胞の標識
1Cell Therapy and Tissue Engineering Group, Research Institute on Health Sciences (IUNICS),University of the Balearic Islands, 2Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa), 3Cellomics Unit, Institut Universitari d’Investigació en Ciències de la Salut (IUNICS),Universitat de les Illes Balears, 4Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (FBSTIB)
Summary
ここでは、変形性関節症のモデルとして使用される軟骨外植の移動および取り込みをモニタリングするために、血小板リセート由来の細胞外小胞にラベルを付けるプロトコルを提示する。
Abstract
細胞外小胞(EV)は、血小板リセート(PL)などの細胞源に由来する貨物による無細胞治療としての可能性を証明するために、異なる研究で使用されています。治療として使用すると、EVは標的細胞に入り、これらからの応答に影響を与える見込みです。本研究では、変形性関節症(OA)の無細胞治療としてPL由来のEVが研究されている。したがって、EVにラベルを付け、軟骨の外植木への取り込みをテストする方法を設定しました。PL誘導EVは、親油性色素PKH26で標識され、カラムを通して2回洗浄され、ナノ粒子追跡分析(NTA)による粒子定量後5時間 のインビトロ 炎症駆動OAモデルで試験される。毎時、軟骨の外植は固定され、パラフィングされ、6μmのセクションに切断されてスライドに取り付けられ、共焦点顕微鏡で観察されます。これにより、この期間中にEVが標的細胞(軟骨細胞)に入るかどうかの検証と、その直接的な効果の分析が可能になります。
Introduction
変形性関節症(OA)は、関節軟骨1の細胞外マトリックスの進行性および不可逆的な炎症および破壊を意味する関節変性疾患である。関節炎の様々な形態は、多数の治療法を持っていますが2,3,4,これらは、その副作用と限られた有効性によって制限されています.自家軟骨細胞移植を用いた組織工学技術は、OA初期の軟骨病変における負傷軟骨の再生治療のために日常的に適用される。細胞ベースの治療法は、主に、軟骨3を効果的に修復することができる限られた数の平種安定な軟骨細胞またはチョンドロゲニターのために制限される。したがって、疾患の進行を予防し、大きな軟骨病変を再生するための新しい治療戦略の開発が最も重要である。
細胞外小胞(EV)は、異なる著者5,6によってOAの治療法として提案されている。EVは、細胞型の大部分によって分泌される膜状体であり、細胞間シグナル伝達に関与しており、そして、それらは最近再生医療への関心を引き出した幹細胞の治療効果7、8、9を発揮することが示されている。間葉間質細胞(MSC)に由来するEVは、OAに関して調査された主な治療用EVであり、他の関節関連細胞はEV源として使用されているが、例えば、チョンドロゲニタまたは免疫細胞11、12。
血小板リサート(PLs)などの血小板濃縮物は、角膜潰瘍13、14、15、腱組織再生16などの異なる傷害における創傷治癒を増強するために使用され、血小板濃縮物のEV成分がこれらの効果に関与する可能性があるという仮説のため17 .関節関連疾患に関連するいくつかの研究は、骨関節炎の状態を改善するための治療法として血小板由来のEV(PL-EV)を使用しています。PL-EVは、Wnt/β-カテニン経路18を活性化することによって軟骨細胞増殖および細胞遊行を改善し、変形性関節症軟骨球19における軟骨形成マーカーの発現を促進し、または、軟骨原性タンパク質のより高いレベルを示し、PL-EV18で治療した骨関節症ウサギの骨関節異常を少なく示す。
EVは、標的細胞に遊離されるタンパク質、脂質、および核酸を含み、それらの治療用途20に関連する主な特徴である細胞間通信を確立する。EVの効果は、その到達セルとその後の貨物放出に依存します。この効果は、代謝活性や遺伝子発現修飾などの細胞内で引き起こされる変化によって間接的に確認することができる。ただし、これらのメソッドでは、EV がセルに到達する方法を視覚化して機能を発揮することはできません。このように、本論文は、これらのPL由来EVを、炎症駆動OA軟骨外植の治療薬として用いる方法を提示する。共焦点顕微鏡は、5時間のタイムラプスで、外植に存在する軟骨細胞へのEV取り込みおよび進行を監視するために使用された。
Protocol
注意:軟骨外植は、CEI-IB(IB 3656118 PI)によるプロジェクトの倫理的承認後、機関ガイドラインに準拠したIdISBaバイオバンク(IB 1995/12 BIO)から取得されました。 1. カラムの準備 製造元の指示に従って、または次のように列を平衡化します。 列のキャップを取り外し、列を平衡にします。溶出によってストレージバッファを取り外します。 リン酸緩衝生理?…
Representative Results
図 1に、EV ラベリングと取り込み監視の概略図の概要を示します。 表1 においてNTAによって検出された粒子濃度およびEVサイズは、カラムで標識した後に2回行った精製工程によるプロセス中にEV濃度が低下することを示す。しかし、得られる量は、処理に使用する粒子数の最適な範囲にある。この粒子濃度は、変形性関節症軟骨外植の治療に使用されるPKH-PL-…
Discussion
EVイメージングは、EVの放出や取り込みメカニズムなどのEV特性を理解するのに役立ちます。彼らのイメージングは、彼らの生体分布の監視と薬物動態特性の薬剤車としての特徴を可能にする。しかし、EVイメージングおよび追跡は、そのサイズが小さいため困難である可能性がありますが、多くのイメージングデバイスおよびラベリング技術は、研究者がin vitroおよびin vivo条件<s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ESF欧州社会基金とERDF欧州地域開発基金(MS16/00124)が共同出資する、インスティトゥート・デ・サルド・カルロス3世、エコノミア・イ・コンペティビビダード大臣(MS16/00124;CP16/00124);プログラムによってジュニアデルプロイエクトタレントプラス,コンストラクションイェルドSALUD, ジェネランドヴァロル (JUNIOR01/18), バレアレス諸島の持続可能な観光税によって資金調達;ディレッキオ・ジェネラル・デインベスティガシオ、コンセラーリア・デ・インベスティガシオ、ガリア統治(FPI/2046/2017);FUTURMed内のFOLIUMポスダリックプログラム(FOLIUM 17/01)によって、バレアレス諸島の持続可能な観光税によって50%、ESFによって50%で賄われた。そして、コミシオ・デ・ドチェンシア・イ・インベスティガシオ・デ・ラ・フンダシオ・バンク・デ・サン・イ・テイシッツ・デ・レ・イレス・バリアーズ(CDI21/03)。
Materials
| Material | |||
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1 mL Syringe BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | Prepared at 20% with Milli-Q water |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolute ethanol Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water |
| Biopsy Punch with plunger 3 mm | Scandidact | MTP-33-32 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Prepared at 5% with PBS |
| Cartilage explants | IdISBa Biobank | ||
| Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega | Pall | MCP100C41 | |
| Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega | Pall | OD003C33 | |
| Cover glass 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX medium | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Embedded paraffin tissue blocks | IdISBa Biobank | Fee for service | |
| Exo-spin mini-HD columns | Cell guidance systems | EX05 | |
| Feather S35 Microtome Blade | Feather | 43037 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| Oncostatin M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 and Dliuent C included |
| Sodium citrate dihydrate | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| TNFα | R&D systems | 210-TA-005 | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water |
| Xylene | Scharlab | XI0050005P | |
| Equipment | |||
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| NanoSight NS300 | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Shandon Finesse 325 Manual Microtome | Thermo Scientific™ | A78100101 | |
| TCS-SPE confocal microscope | Leica Microsystems | 5200000271 |
References
- Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
- Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, &. #. 3. 2. 1. ;., Szponder, T. Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering. In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).
- Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions. Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Burke, J., et al. et al.Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clinical and Translational Medicine. 5 (1), 27 (2016).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).
- Bruno, S., et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).
- Bruno, S., Camussi, G. Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair. Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).
- Théry, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- D’Arrigo, D., et al. Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867 (2019).
- Ryan, S. T., et al. Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).
- El Backly, R., et al. Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response. Tissue Engineering. Part A. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).
- Yuta, K., et al. Graefe’s archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).
- Del Bue, M., et al. Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes. Veterinary Research Communications. 31, 289-292 (2007).
- Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212 (2018).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).
- Liu, X., et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470 (2019).
- Otahal, A., et al. Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050 (2020).
- Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment. International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).
- Ortega, F. G., et al. Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014 (2019).
- de Miguel Pérez, D., et al. Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Morelli, A. E., et al. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).
- Feng, D., et al. Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25, 91 (2018).
- Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432 (2001).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Takahashi, Y., et al. Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection. Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).
- Askenasy, N., Farkas, D. L. Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).
- Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model. Inflammation and Regeneration. 36, 26 (2016).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Skardelly, M., et al. Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).
- Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. Sigma-Aldrich Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html (2021)
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
- Morales-Kastresana, A., et al. Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).
Citer Cet Article
Forteza-Genestra, M. A., Antich-Rosselló, M., Ortega, F. G., Ramis-Munar, G., Calvo, J., Gayà, A., Monjo, M., Ramis, J. M. Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants. J. Vis. Exp. (176), e62780, doi:10.3791/62780 (2021).