Funcionalización de vesículas extracelulares derivadas de plaquetas de implantes ti
Summary
Aquí, presentamos un método para el aislamiento de vesículas extracelulares (EV) derivadas de los lisados plaquetarios (PL) y su uso para recubrir superficies de implantes de titanio (Ti). Describimos el método de recubrimiento de fundición por gota, el perfil de liberación de EV de las superficies y la biocompatibilidad in vitro de las superficies Ti recubiertas de EV.
Abstract
Las vesículas extracelulares (EV) son nanovesículas biológicas que desempeñan un papel clave en la comunicación celular. Su contenido incluye biomoléculas activas como proteínas y ácidos nucleicos, que presentan un gran potencial en medicina regenerativa. Más recientemente, los EV derivados del lisado plaquetario (PL) han demostrado una capacidad osteogénica comparable a pl. Además, los biomateriales se utilizan con frecuencia en ortopedia o restauración dental. Aquí, proporcionamos un método para funcionalizar las superficies de Ti con EV derivados de PL para mejorar sus propiedades osteogénicas.
Los EV se aíslan de PL mediante cromatografía de exclusión de tamaño, y luego las superficies de Ti se funcionalizan con PL-EV mediante fundición por gota. La funcionalización se demuestra mediante la liberación de EV y su biocompatibilidad mediante el ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH).
Introduction
Los EV son vesículas de membrana (30-200 nm) secretadas por cualquier célula y desempeñan un papel clave en la comunicación de célula a célula al entregar su carga. Contienen una variedad de biomoléculas activas que pueden incluir ácidos nucleicos, factores de crecimiento o lípidos bioactivos1. Por estas razones, los EV han sido evaluados por su uso potencial en terapias. En términos de ortopedia y regeneración ósea, se han probado evs de diferentes fuentes. Entre ellos, se ha demostrado que los EV derivados de plaquetas inducen un efecto de diferenciación sobre las células madre manteniendo un perfil citotóxico bajo2,3. Por lo tanto, se requiere más investigación para explorar la posibilidad de combinar evs con biomateriales para usarlos en la práctica clínica diaria.
Los biomateriales a base de titanio son ampliamente utilizados como andamios para intervenciones clínicas de curación ósea debido a sus propiedades mecánicas, alta biocompatibilidad y durabilidad a largo plazo4. Sin embargo, los implantes ti son un material bioinerte y, por lo tanto, presentan una escasa capacidad de unión con el tejido óseo circundante5. Por este motivo, se están estudiando modificaciones de titanio con el fin de mejorar su rendimiento consiguiendo un microambiente más funcional en su superficie4,6,7. En este sentido, los vehículos eléctricos pueden anclarse al titanio mediante interacciones químicas8 o físicas9,10. Los EV inmovilizados derivados de células madre o macrófagos potencian la bioactividad del Ti al favorecer la adhesión y proliferación celular induciendo así un efecto osteogénico8,9,10.
Este artículo se centrará en una estrategia de fundición por gota para recubrir superficies Ti con vehículos eléctricos derivados de PL en detalle. Además, evaluaremos el perfil de liberación de evs de la superficie recubierta a lo largo del tiempo y confirmaremos su biocompatibilidad celular in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo tiene como objetivo proporcionar instrucciones claras para la funcionalización de los vehículos eléctricos en las superficies ti. El método presentado se basa en una estrategia de drop casting, que es un tipo de funcionalización de fisiorción. Existe una bibliografía deficiente con respecto a la funcionalización de los evs en las superficies de Ti, aunque hay pocos estudios que muestren diferentes ventajas al inmovilizar los EV en Ti10. De todos modos, algunas de las estrate…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación ha sido financiada por el Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, cofinanciada por el Fondo Social Europeo del FSE y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional FEDER (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), la Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017), y el PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financiados por el impuesto de turismo sostenible de las Islas Baleares.
Materials
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
References
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