Funcionalização vesícula extracelular derivada de plaquetas de implantes ti
Summary
Aqui, apresentamos um método para o isolamento de Vesículas Extracelulares (EVs) derivados das plaquetas (PL) e seu uso para revestimento de superfícies de implante de titânio (Ti). Descrevemos o método de revestimento de fundição de gota, o perfil de liberação de EVs das superfícies e a biocompatibilidade in vitro de superfícies Ti revestidas de EVs.
Abstract
Vesículos extracelulares (EVs) são nanovesculas biológicas que desempenham um papel fundamental na comunicação celular. Seu conteúdo inclui biomoléculas ativas, como proteínas e ácidos nucleicos, que apresentam grande potencial na medicina regenerativa. Mais recentemente, os EVs derivados de Plaqueta Lysate (PL) mostraram uma capacidade osteogênica comparável ao PL. Além disso, os biomateriais são frequentemente utilizados em ortopedia ou restauração dentária. Aqui, fornecemos um método para funcionalizar superfícies ti com EVs derivados de PL, a fim de melhorar suas propriedades osteogênicas.
Os EVs são isolados do PL por cromatografia de exclusão de tamanho, e depois as superfícies ti são funcionalizadas com PL-EVs por fundição de gota. A funcionalidade é comprovada pela liberação de EVs e sua biocompatibilidade pelo ensaio de liberação de lactato desidrogenase (LDH).
Introduction
Os EVs são vesículas de membrana (30-200 nm) secretadas por qualquer célula e desempenham um papel fundamental na comunicação célula-celular, entregando sua carga. Eles contêm uma variedade de biomoléculas ativas que podem incluir ácidos nucleicos, fatores de crescimento ou lipídios bioativos1. Por essas razões, os EVs têm sido avaliados por seu potencial uso na terapêutica. Em termos de ortopedia e regeneração óssea, EVs de diferentes fontes foram testados. Entre eles, os EVs derivados de plaquetas têm sido mostrados para induzir um efeito de diferenciação sobre as células-tronco, mantendo um perfil citotóxico baixo2,3. Portanto, mais pesquisas são necessárias para explorar a possibilidade de combinar EVs com biomateriais para usá-los na prática clínica diária.
Os biomateriais à base de titânio são amplamente utilizados como andaimes para intervenções clínicas de cicatrização óssea devido às suas propriedades mecânicas, alta biocompatibilidade e durabilidade a longo prazo4. No entanto, os implantes ti são um material biointendo e, portanto, apresentam uma baixa capacidade de ligação com o tecido ósseo circundante5. Por essa razão, modificações de titânio estão sendo estudadas para melhorar seu desempenho, alcançando um microambiente mais funcional em sua superfície4,6,7. Nesse sentido, os EVs podem ser ancorados em titânio por interações químicas8 ou físicas9,10. EVs imobilizados derivados de células-tronco ou macrófagos aumentam a bioatividade de Ti, promovendo a adesão celular e a proliferação, induzindo assim um efeito osteogênico8,9,10.
Este artigo se concentrará em uma estratégia de lançamento de gota para revestimento de superfícies Ti com EVs derivados de PL em detalhes. Além disso, avaliaremos o perfil de liberação de EVs da superfície revestida ao longo do tempo e confirmaremos sua biocompatibilidade celular in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo visa fornecer instruções claras para a funcionalização dos EVs nas superfícies ti. O método apresentado baseia-se em uma estratégia de fundição de gota, que é um tipo de funcionalização de fissionação. A má bibliografia existe em relação à funcionalização de EVs nas superfícies de Ti, embora existam poucos estudos mostrando diferentes vantagens ao imobilizar EVs no Ti10. De qualquer forma, algumas das estratégias exploradas incluem ligação bioquímica8, armad…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, co-financiado pelo Fundo Social Europeu da ESF e pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional do ERDF (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), o Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017) e PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financiado pelo imposto sobre o turismo sustentável das Ilhas Baleares.
Materials
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
References
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