Ti İmplantların TrombositTen Türetilmiş Hücre Dışı Veziklin İşlevselleştirilmesi
Summary
Burada, trombosit lysates (PL) elde edilen Hücre Dışı Vezikliklerin (EV) izolasyonu ve titanyum (Ti) implant yüzeylerinin kaplanması için kullanımları için bir yöntem sunuyoruz. Damla döküm kaplama yöntemini, yüzeylerden EV salınım profilini ve EV kaplamalı Ti yüzeylerinin in vitro biyouyumluluğunu açıklıyoruz.
Abstract
Hücre dışı Veziklinler (EV’ ler) hücre iletişiminde kilit rol oynayan biyolojik nanovesiküllerdir. İçerikleri, rejeneratif tıpta büyük potansiyel sunan proteinler ve nükleik asitler gibi aktif biyomolekülleri içerir. Daha yakın zamanda, Platelet Lysate’den (PL) elde edilen EV’ler PL ile karşılaştırılabilir bir osteojenik yetenek göstermiştir. Ayrıca, biyomalzemeler ortopedide veya diş restorasyonunda sıklıkla kullanılmaktadır. Burada, osteojenik özelliklerini geliştirmek için Ti yüzeylerini PL türevli EV’lerle işlevselleştirmek için bir yöntem sunuyoruz.
EV’ler PL’den boyut dışlama kromatografisi ile izole edilir ve daha sonra Ti yüzeyleri pl-EV’ler ile damla dökümü ile işlevsel hale getirilir. fonksiyonelleştirme, ED’lerin salınımı ve biyouyumluluğu laktat dehidrogenaz (LDH) salınımı test ile kanıtlanmıştır.
Introduction
EV’ler herhangi bir hücre tarafından salgılanan membran veziklinlerdir (30-200 nm) ve kargolarını teslim ederek hücreden hücreye iletişimde kilit rol oynarlar. Nükleik asitler, büyüme faktörleri veya biyoaktif lipitler içerebilecek çeşitli aktif biyomoleküller içerirler1. Bu nedenlerle, EV’ler terapötiklerde potansiyel kullanımları açısından değerlendirilmiştir. Ortopedi ve kemik yenilenmesi açısından farklı kaynaklardan gelen EV’ler test edilmiştir. Bunlar arasında trombosit türevli EV’lerin düşük sitotoksik profili korurken kök hücreler üzerinde farklılaşma etkisi yarattığı gösterilmiştir2,3. Bu nedenle, günlük klinik uygulamalarda kullanmak için EV’leri biyomalzemelerle birleştirme olasılığını araştırmak için daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir.
Titanyum bazlı biyomalzemeler, mekanik özellikleri, yüksek biyouyumlulukları ve uzun süreli dayanıklılıkları nedeniyle kemik iyileştirici klinik müdahaleler için iskele olarak yaygın olarak kullanılmaktadır4. Bununla birlikte, Ti implantlar biyoinert bir malzemedir ve bu nedenle çevredeki kemik dokusuyla bağlanmak için zayıf bir yetenek sunar5. Bu nedenle yüzeyinde daha fonksiyonel bir mikroçevrme elde ederek performanslarını artırmak için titanyum modifikasyonları çalışılmaktadır4,6,7. Bu anlamda, EV’ler kimyasal8 veya fiziksel etkileşimlerle titanyuma tutturulabilir9,10. Kök hücrelerden veya makrofajlardan elde edilen hareketsiz EV’ler, hücresel yapışıklığı ve çoğalmayı teşvik ederek Ti’nin biyoaktivitesini arttırır ve böylece osteojenik bir etki yaratır8,9,10.
Bu makalede, Ti yüzeylerinin PL türevli EV’lerle ayrıntılı olarak kaplanması için bir damla döküm stratejisi üzerinde durulacaktır. Buna ek olarak, EV’lerin zaman içinde kaplamalı yüzeyden çıkış profilini değerlendireceğiz ve hücresel biyouyumluluk in vitrosunu onaylayacağız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, Ti yüzeylerinde EV’lerin işlevselleştirilmesi için net talimatlar sağlamayı amaçlamaktadır. Sunulan yöntem, bir fonksiyonelleştirmenin fitorpsiyon türü olan bir damla döküm stratejisine dayanmaktadır. Ti yüzeylerinde EV fonksiyonelleştirme ile ilgili kötü kaynakça mevcuttur, ancak Ti10’da EV’leri hareketsiz hale getirmenin farklı avantajlarını gösteren çok az çalışma vardır. Her neyse, araştırılan stratejilerden bazıları biyokimyasal <sup class="xref"…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, ESF Avrupa Sosyal Fonu ve ERDF Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (MS16/00124) tarafından ortaklaşa finanse edilen Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad tarafından finanse edildi; CP16/00124; PI17/01605), Balear Adaları’nın sürdürülebilir turizm vergisi tarafından finanse edilen Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017) ve PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18).
Materials
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
References
- Van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Torreggiani, E., et al. Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity. European Cells & Materials. 28, 137-151 (2014).
- Antich-Rosselló, M., et al. Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells. Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).
- Li, Y., et al. New developments of Ti-based alloys for biomedical applications. Materials. 7 (3), 1709-1800 (2014).
- Lan, W. C., et al. The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors. Applied Sciences. 10 (2), 590 (2020).
- Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. Surface modifications and their effects on titanium dental implants. BioMed Research International. 2015, 791725 (2015).
- Damiati, L., et al. Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants. Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694 (2017).
- Chen, L., et al. Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).
- Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration. Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).
- Wang, X., et al. Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces. Biomaterials. 230, 119571 (2020).
- Lozano-Ramos, I., et al. Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Liu, J., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541 (2018).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , (2021).
- Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudré, C. Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications. Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).
- Córdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., González-Martín, M. L., Ramis, J. M. Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage. ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).
