血小板衍生的Ti植入物的细胞外囊泡功能化
1Cell Therapy and Tissue Engineering Group, Research Institute on Health Sciences (IUNICS),University of the Balearic Islands, 2Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa), 3Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (FBSTIB), 4Department of Fundamental Biology and Health Sciences,University of the Balearic Islands
Summary
在这里，我们提出了一种分离来自血小板裂解物（PL）的细胞外囊泡（EV）的方法及其用于包衣钛（Ti）植入物表面的方法。我们描述了滴铸涂层方法，电动汽车从表面的释放曲线，以及电动汽车涂层Ti表面的 体外 生物相容性。
Abstract
细胞外囊泡（EV）是生物纳米囊泡，在细胞通讯中起关键作用。其含量包括蛋白质和核酸等活性生物分子，在再生医学中具有巨大的潜力。最近，来自血小板裂解物（PL）的EV显示出与PL相当的成骨能力。此外，生物材料经常用于骨科或牙齿修复。在这里，我们提供了一种用PL衍生的EV功能化Ti表面的方法，以改善其成骨性能。
通过尺寸排阻色谱法从PL中分离出EV，然后通过滴铸将Ti表面与PL-EV功能化。功能化通过EV释放和乳酸盐脱氢酶（LDH）释放测定的生物相容性得到证明。
Introduction
EV是由任何细胞分泌的膜囊泡（30-200nm），通过传递其货物在细胞间通信中起着关键作用。它们含有多种活性生物分子，其中可能包括核酸、生长因子或生物活性脂质1。由于这些原因，电动汽车已被评估其在治疗中的潜在用途。在骨科和骨再生方面，来自不同来源的EV已经过测试。其中，血小板衍生的EV已被证明可以诱导干细胞的分化作用，同时保持低细胞毒性2，3。因此，需要进一步的研究来探索将EV与生物材料相结合的可能性，以便在日常临床实践中使用它们。
钛基生物材料由于其机械性能、高生物相容性和长期耐用性，被广泛用作骨愈合临床干预的支架4。然而，Ti植入物是一种生物惰性材料，因此与周围骨组织的结合能力较差5。因此，正在研究钛改性，以便通过在其表面实现功能更强大的微环境来提高其性能4，6，7。从这个意义上说，电动汽车可以通过化学8 或物理相互作用与钛锚定9，10。来自干细胞或巨噬细胞的固定化EV通过促进细胞粘附和增殖来增强Ti的生物活性，从而诱导成骨作用8，9，10。
本文将重点介绍使用PL衍生的EV涂覆Ti表面的液滴铸造策略。此外，我们将评估EV在一段时间内从包被表面的释放曲线，并在 体外确认其细胞生物相容性。
Protocol
血小板裂解物（PL）按照先前所述使用IdISBa生物库提供的新鲜白蛋白涂层作为起始材料获得，符合机构指南3 。它们在当前项目中的使用得到了其道德委员会的批准（IB 1995/12 BIO）。 1. 电动汽车与PL隔离 较大的身体移除 在室温下解冻PL。 在4°C下以1，500× g 离心PL15分钟。 丢弃含有细胞碎片的沉淀。 收集上清液并在4°C下以1…
Representative Results
本文中介绍的方法允许获得EV功能化的钛盘。电动汽车与表面物理粘合，这允许随着时间的推移持续释放。NTA可以在第2天，第6天，第10天和第14天测量释放的EV数量。第2天的第一次测量显示，大约有109 辆电动汽车被释放，然后在第6天持续释放（约108 辆电动汽车）;第10天（约107 辆电动汽车）和第14天（约107 辆电动汽车）。这证实了持续释放，尽管随着时间的推移?…
Discussion
该协议旨在为电动汽车在Ti表面上的功能化提供明确的说明。所提出的方法基于液滴铸造策略，这是一种物理吸附类型的功能化。关于Ti表面上的EV功能化，书目很差，尽管很少有研究表明在Ti10上固定EV具有不同的优势。无论如何，探索的一些策略包括生化结合8，聚合物截留9 或滴铸10。虽然通过共价键使用化学涂层可能会实?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究由卡洛斯三世社会研究所资助，由欧洲社会基金和ERDF欧洲区域发展基金共同资助（MS16/00124;CP16/00124;PI17/01605）、Direcció General d’Investigació、Conselleria d’Investigació、Govern Balear （FPI/2046/2017）和PROJECTA JUNIOR DEL PROJECTE TALENT PLUS， construyendo SALUD， generando VALOR （JUNIOR01/18），由巴利阿里群岛的可持续旅游税资助。
Materials
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
References
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Citer Cet Article
Antich-Rosselló, M., Forteza-Genestra, M. A., Calvo, J., Gayà, A., Monjo, M., Ramis, J. M. Platelet-Derived Extracellular Vesicle Functionalization of Ti Implants. J. Vis. Exp. (174), e62781, doi:10.3791/62781 (2021).