Kvalitetsstyrd Sputumanalys efter flödescytometri

Summary

Detta protokoll beskriver en effektiv metod för att dissociera sputum i en enda cell suspension och efterföljande karakterisering av cellulära delmängder på standard flöde cytometriska plattformar.

Abstract

Sputum, som ofta används för att studera cellulärt innehåll och andra mikromiljöfunktioner för att förstå lungans hälsa, analyseras traditionellt med hjälp av cytologibaserade metoder. Dess användbarhet är begränsad eftersom läsning av bilderna är tidskrävande och kräver högspecialiserad personal. Dessutom gör omfattande skräp och förekomsten av alltför många skivepitelceller (SECs), eller kindceller, ofta ett prov otillräckligt för diagnos. Däremot möjliggör flödescytometri fenotypning med hög genomströmning av cellulära populationer samtidigt som skräp och SEC exkluderas.

Protokollet som presenteras här beskriver en effektiv metod för att dissociera sputum i en enda cell suspension, antikroppsfläck och fixa cellulära populationer, och förvärva prover på en flöde cytometrisk plattform. En gating strategi som beskriver uteslutandet av skräp, döda celler (inklusive SECs) och celldubbel presenteras här. Vidare förklarar detta arbete också hur man analyserar livskraftiga, enstaka sputumceller baserat på ett kluster av differentiering (CD)45 positiva och negativa populationer för att karakterisera hematopoetiska och epitelial härstamning undergrupper. En kvalitetskontrollåtgärd tillhandahålls också genom att identifiera lungspecifika makrofager som bevis för att ett prov härrör från lungan och inte är saliv. Slutligen har det visats att denna metod kan tillämpas på olika cytometriska plattformar genom att tillhandahålla sputum profiler från samma patient analyseras på tre flöde cytometer. Navios EX, LSR II och Lyric. Dessutom kan detta protokoll ändras för att inkludera ytterligare cellulära markörer av intresse. En metod för att analysera ett helt sputumprov på en flöde cytometrisk plattform presenteras här som gör sputum mottaglig för att utveckla hög genomströmning diagnostik av lungsjukdom.

Introduction

Tekniska framsteg inom hårdvara och programvara för flödescytometrar har gjort det möjligt att identifiera många distinkta cellpopulationer samtidigt1,2,3,4. Användningen av flödescytometern i hematopoetisk cellforskning har till exempel lett till en mycket bättre förståelse för ^{immunsystemet2} och den cellulära hierarkin i det hematopoetiska ^systemet5, liksom den diagnostiska skillnaden mellan en mängd olika blodcancer6,7,8. Även om de flesta sputumceller är av hematopoietic ursprung9,10,11, flöde cytometri har inte använts i stor utsträckning på sputum analys för diagnostiska ändamål. Flera studier tyder dock på att utvärderingen av immuncellpopulationer i sputum (den viktigaste delmängden av celler) kan vara till stor hjälp vid diagnos och/eller övervakning av sjukdomar som astma och kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL)12,13,14,15. Dessutom tillåter förekomsten av epitelspecifika markörer som kan användas i flödescytometri förhör av följande viktigaste delmängd av celler i sputum, lungepitetelceller.

Förutom förmågan att analysera många distinkta cellpopulationer av olika vävnadsursprung kan en flödescytometer utvärdera ett stort antal celler på relativt kort tid. I jämförelse kräver glidbaserade, cytologiska typer av analyser ofta högspecialiserad personal och/eller utrustning. Dessa analyser kan vara arbetsintensiva, vilket leder till att endast en del av sputumprovet ^analyseras16.

Tre kritiska frågor begränsar den utbredda användningen av sputum i flöde cytometri. Det första numret gäller insamlingen av sputum. Sputum samlas in genom en huff hosta som utvisar slem från lungorna i munhålan och därefter spottar i en samlingskopp. Eftersom slem färdas genom munhålan finns det en stor risk för SEC-förorening. Denna förorening komplicerar provanalysen, men problemet åtgärdas enkelt på en flödescytometrisk plattform, vilket visas i denna studie.

Inte alla kan producera sputum spontant; Därför har flera enheter utvecklats för att hjälpa till med sputum insamling på ett icke-invasivt ^sätt17. Nebulisatorn är en sådan anordning och har visat sig producera tillförlitliga sputumprover18,19,20. Även om nebulisatorn är ett mycket effektivt sätt att icke-invasivt samla sputum, kräver dess användning fortfarande en inställning på en medicinsk anläggning med specialiserad ^personal21. Handhållna enheter som lungflöjt22,23,24 och acapella16,25 kan däremot användas hemma eftersom de är mycket användarvänliga. Dessa hjälpenheter är både säkra och kostnadseffektiva.

För oss gav acapella konsekvent bättre resultat än lungflöjt16, och därför har acapella-enheten valts för sputumsamlingar. Ett 3-dagars insamlingsprov bestämdes eftersom det primära syftet med att använda sputum är att utveckla ett test för ^{lungcancerdetektering16}. Det har visat sig att ett 3-dagars prov ökar sannolikheten för upptäckt av lungcancer jämfört med ett 1- eller 2-dagars prov26,27,28. Andra metoder för sputumsamling kan dock vara att föredra för olika ändamål. Om en annan sputumuppsamlingsmetod används än den som beskrivs här, rekommenderas att noggrant titrera varje antikropp eller färgämne som används för flödescytometrisk analys. det finns mycket lite data om hur olika sputum insamlingsmetoder påverkar de riktade proteinerna för flödescytometri.

Den andra frågan som dämpar entusiasmen för att använda sputum för diagnostik, främst relaterad till flödescytometri, är cellnummer. Problemet är insamlingen av tillräckligt livskraftiga celler för en tillförlitlig analys. Två studier visade att sputumprover som samlats in med icke-invasiva metoder, med hjälp av en hjälpanordning, innehåller tillräckligt med livskraftiga celler som kan användas i kliniska diagnos- eller ^{forskningsstudier16,24}. Ingen av dessa studier tog dock upp frågan om cellnummer avseende flödescytometri.

För de studier som ligger till grund för detta protokoll samlades sputumprover in från deltagare med hög risk för att utveckla lungcancer enligt godkända institutionella riktlinjer för varje studieplats. Högriskdeltagare definierades som mellan 55-75 år, efter att ha rökt 30 packår och inte slutat röka under de senaste 15 åren. Patienterna visades hur man använder acapella-enheten enligt tillverkarens ^{instruktioner29} och samlade sputum under tre dagar i följd hemma. Provet förvarades i kylskåp fram till den sista samlingen. På den sista insamlingsdagen skickades provet till laboratoriet över natten med en frusen kall förpackning. Proverna bearbetades till en enda cell suspension samma dag som de togs emot. Med denna metod för sputum insamling erhålls mer än tillräckligt livskraftiga celler för en tillförlitlig flöde cytometrisk analys.

Slutligen, och relaterad till föregående cellnummer fråga, är frågan om hur man släpper sputumcellerna från dess mucinous miljö. Hur kan cellerna hållas livskraftiga och skapa en enda cellfjädring som inte täpper till flödescytometern? Baserat på det inledande arbetet av Pizzichini et ^al.30 och Miller et ^al.31 beskriver detta protokoll en enkel och pålitlig metod för sputumbehandling till en enda cellfjädring som är lämplig för flödescytometrisk analys. Denna metod har använt väletablerade riktlinjer i flödescytometri32,33,34 för att utveckla en effektiv antikroppsmärkningsstrategi för att identifiera hematopoetiska och epitelceller i sputum och tillhandahålla instrumentinställningar, kvalitetskontrollåtgärder och analysriktlinjer som standardiserar sputumanalys på en flödescytometrisk plattform.

Protocol

Alla steg i sputumbehandlingen utförs i ett biologiskt säkerhetsskåp med lämplig personlig skyddsutrustning. 1. Reagensberedning innan sputumdissociation påbörjas Tina 1% Paraformaldehyd (PFA), 25 ml per prov på is och håll dig kall tills den används.VARNING: PFA är giftigt vid inandning och hudkontakt. Förbered fixativet enligt tillverkarens instruktioner och frys vid -20 °C i 25 ml alikvoter tills de används. Approximera provets vikt och tina tillräcklig…

Representative Results

Detta protokoll utvecklades med en klinisk laboratorium inställning i åtanke. Fokus under utvecklingen av protokollet låg på enkelhet, effektivitet och reproducerbarhet. Det konstaterades att det mest tidskrävande steget i bearbetningen av sputum var att räkna cellerna. Därför är protokollet konfigurerat på ett sådant sätt att sputumbearbetning och cellmärkning kan utföras oberoende av cellräkning utan tidsförlust. Ett korrekt cellantal, som fortfarande är nödvändigt för att späda ut provet på lämp…

Discussion

Det cellulära innehållet i sputum innehåller ett stort antal omfattande celler, ofta åtföljda av mycket ^skräp37. Dessutom kräver sputumanalys en kvalitetskontroll som bekräftar att provet samlas in från lungan istället för ^munhålan38. Därför är det inte lika enkelt att analysera sputum efter flödescytometri som det är för blod, till exempel, vilket frigör en mycket renare och homogen cellupphängning. Detta protokoll har tagit itu med alla dessa problem: …

Materials

1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061