Imaging-derived mean square displacement (iMSD) analys tillämpas på makropinosomer för att belysa deras inneboende tidsutveckling natur när det gäller strukturella och dynamiska egenskaper. Makropinosomer jämförs sedan med insulinsekretoriska granuler (ISG) som referens för subcellulära strukturer med tidsinvarianta genomsnittliga strukturella/dynamiska egenskaper.
Imaging-derived mean square displacement (iMSD) används för att ta itu med de strukturella och dynamiska egenskaperna hos subcellulära nanostrukturer, såsom vesiklar som är involverade i endo/exocytotisk handel med lösta ämnen och biomolekyler. iMSD förlitar sig på standard time-lapse-avbildning, är kompatibel med alla optiska inställningar och behöver inte bo på enskilda objekt för att extrahera banor. Från varje iMSD-spår beräknas och kombineras en unik triplett av genomsnittliga strukturella och dynamiska parametrar (dvs. storlek, lokal diffusivitet, avvikande koefficient) för att bygga “iMSD-signaturen” för den nanostruktur som studeras.
Styrkan i detta tillvägagångssätt bevisas här med det exemplifierande fallet med makropinosomer. Dessa vesiklar utvecklas i tid och ändrar deras genomsnittliga storlek, antal och dynamiska egenskaper som passerar från tidiga till sena stadier av intracellulär handel. Som en kontroll används insulinsekretoriska granuler (ISG) som referens för subcellulära strukturer som lever i ett stationärt tillstånd där de genomsnittliga strukturella och dynamiska egenskaperna hos hela populationen av objekt är invarianta i tid. iMSD-analysen belyser dessa särdrag kvantitativt och banar väg för liknande applikationer på subcellulär nivå, både i fysiologiska och patologiska tillstånd.
Subcellulära nanostrukturer (t.ex. endocytiska/sekretoriska vesiklar, organeller) spelar en central roll i cellsignalreglering1. Korrekt inställning av deras strukturella (t.ex. storlek) och / eller dynamiska (t.ex. diffusivitet) egenskaper bestämmer hur cellen svarar på inre eller yttre stimuli 2,3,4. Baserat på detta bevis är det inte förvånande att förändringar av dessa egenskaper finns i många patologiska tillstånd. Exempel omfattar rollen av felreglerad endocytos i cancer 2,3, de strukturella och dynamiska förändringar som finns på nivån av ISG i β-celler som utsätts för typ 2-diabetestillstånd5, felreglering av lysosomala strukturella och transportegenskaper i globoidcellleukodystrofi eller galaktosylceramidlipidos6 och dysfunktionaliteter i endo-lysosomal väg vid neurodegenerativa störningar (t.ex. Alzheimers sjukdom)7.
I detta sammanhang har forskare nyligen bevisat att prestandan hos vanliga optiska mikroskopimetoder kan förbättras genom korrekt inställning av rumslig och tidsmässig samplingsupplösning8. Detta kan i sin tur ge ytterligare insikt i biologiska processer av relevans. I praktiken möjliggörs detta av en algoritm för spatiotemporal fluktuationsanalys, som samtidigt extraherar de genomsnittliga strukturella och dynamiska egenskaperna hos diffusa objekt direkt från standardstacken av optiska mikroskopibilder utan behov av preliminär kunskap om det biologiska objektet av intresse och extraktion av enobjektbanor. All denna information bifogas i en enda utgång från metoden: ett iMSD-spår9 (detaljer om iMSD-spårhärledning och analys ges i tilläggsfil 1).
Det resulterande experimentella protokollet består av några steg. För det första utförs avbildning av den intressanta regionen med hög tidsupplösning. Därefter beräknas genomsnittliga rumsliga-temporala korrelationsfunktioner från stapeln med bilder. Slutligen, genom Gaussisk anpassning av serien av korrelationsfunktioner, erhålls den genomsnittliga “diffusionslagen” direkt från avbildning och analyseras för att känna igen objektdiffusionsläget. Metodens potential var redan bevisad för en mängd olika biologiska föremål, allt från molekyler till nanopartiklar och till och med hela subcellulära organeller / strukturer 9,10,11,12,13,14,15.
Detta dokument rapporterar iMSD-tillämpning på makropinosomer för att belysa deras inneboende, irreversibla tidsutvecklingskaraktär när det gäller deras genomsnittliga (dvs. på hela befolkningsnivå) strukturella och dynamiska egenskaper. Vidare jämförs dessa endocytiska vesiklar med ISG som referens för subcellulära strukturer i ett “stationärt tillstånd”, dvs ett tillstånd där de genomsnittliga strukturella/dynamiska egenskaperna hos hela populationen av granulat förblir konstanta när som helst. Makropinocytos definierar en serie händelser initierade av den omfattande omorganisationen (eller ruffling) av plasmamembranet för att bilda en extern makropinocytisk struktur som sedan internaliseras16. De bildade makropinosomerna i tidigt stadium liknar fagosomer. Samtidigt kan de särskiljas från andra former av endocytiska vesiklar på grund av deras karakteristiska stora storlek, morfologiska heterogenitet och brist på proteinbeläggningsstrukturer.
Biokemiska analyser avslöjade att makropinosomer vid internalisering gradvis berikas med proteinmarkörer för andra endocytiska vägar, vilket i sin tur tyder på att deras identiteter kontinuerligt förändras under människohandel17. Med hjälp av antikroppar mot kända markörer i den endosomala vägen visades att makropinosomer gradvis antar klassiska endosomala egenskaper: de minskar i storlek, utvecklas till sena endocytiska strukturer (t.ex. lysosomer) eller så småningom förlorar sin identitet via membranmedierad hämtning av specifika molekylära markörer (t.ex. sortering av nexiner)18,19 . Det övergripande scenariot är att varje enskild makropinosom i cellen irreversibelt ändrar sin strukturella och dynamiska (såväl som molekylära) identitet under smuggling från plasmamembranet till dess slutliga intracellulära öde. Som ett resultat förändras också de strukturella/ dynamiska / molekylära egenskaperna hos hela populationen av makropinosomer längs samma tidsmässiga väg. Eftersom iMSD-metoden i sig är känslig för de genomsnittliga egenskaperna hos hela populationen av observerade objekt, visar den kvantitativt den “föränderliga naturen” genom kvantifiering av viktiga genomsnittliga parametrar, dvs. den lokala diffusiviteten och avvikande koefficienten (dynamiska egenskaper) och makropinosomernas genomsnittliga storlek (strukturell egenskap) i något skede av deras intracellulära handel.
Som jämförelse utfördes liknande mätningar på en välkänd intracellulär membransluten struktur, ISG, i en modell av β-celler. Liksom makropinosomer är regleringen av ISG: s strukturella och dynamiska egenskaper, från deras uppkomst vid Trans Golgi Network (TGN) till deras exocytos vid plasmamembranet, avgörande för korrekt utförande av ISG-funktion20. Till skillnad från makropinosomer lever EME-er i ett “stationärt tillstånd” där alla funktionella/strukturella/molekylära stadier av ISG-livslängden när som helst samtidigt finns i cellen, och var och en representeras av en specifik delpopulation av ISG. Detta innebär att även om varje enskild granulat irreversibelt utvecklas från biogenes till utsöndring, förväntas de genomsnittliga strukturella/dynamiska egenskaperna hos hela populationen av granulat förbli konstanta när som helst (såvida inte de stationära tillståndsförhållandena ändras, till exempel av yttre stimuli som glukos, kolesterol och cytokiner13). Detta bekräftas av iMSD-analys.
Egenskaperna och fördelarna med iMSD är uppenbara jämfört med de tekniker som finns tillgängliga för att hämta analog information. För strukturell information är det föredragna valet överföringselektronmikroskopi (TEM) analys. Med denna metod kan ultrastrukturella detaljer vid molekylär upplösning och till och med bortom hämtas, även för subcellulära nanostrukturer. Ändå uppnås den speciella rumsliga upplösningen av TEM på bekostnad av informationen i den tidsmässiga dimensionen, vilket är av intresse här. För att kompensera för detta är de senaste framstegen inom levande cellavbildningsteknik av särskilt intresse. Dessa inkluderar nya fluorescerande markörer med ökad prestanda (t.ex. ljusstyrka och fotostabilitet), optimerade märkningsprocedurer och känsligare detektorer. Dessutom finns analysverktyg tillgängliga för att hantera både strukturell (t.ex. “storlek” genom fasorbaserad analys av lokal bildkorrelationsspektroskopi, PLICS23, aggregering/oligomerisering genom tal- och ljusstyrkeanalys24) och dynamisk (t.ex. diffusionslag genom enpartikelspårning, dvs. (SPT)25,26,27,28 ) parametrar på den subcellulära skalan. SPT-metoden ger direkt tillgång till objektets bana och dess MSD. Nackdelen är emellertid behovet av en låg densitet hos sonden och mycket ljusa etiketter och många enobjektbanor som ska mätas för att uppfylla statistiska kriterier. När det gäller mätningens tidsmässiga upplösning kan oorganiska, fotosterbara sonder (t.ex. kvantprickar eller metallnanopartiklar) öka SPT-prestandan men på bekostnad av komplexa produktions- och märkningsförfaranden.
Jämfört med dessa standarder visar iMSD-metoden som beskrivs här några viktiga fördelar. För det första kan detta tillvägagångssätt användas tillsammans med relativt svaga fluorescerande taggar, såsom genetiskt kodade fluorescerande proteiner (t.ex. tillämpningen på ISG). Således, jämfört med SPT, uppnås en högre tidsmässig upplösning (med samma etikett) på grund av den lägre mängden fotoner som krävs8. För det andra begränsas iMSD-metoden endast av den tidsmässiga upplösningen men inte av diffraktionen. Faktum är att trots den diffraktionsbegränsade optiska inställningen som används kan genomsnittliga molekylära förskjutningar även under diffraktionsgränsen mätas, vilket redan visats för molekylära flöden med hjälp av STICS29. Den faktiska upplösningen vid mätning av förskjutningar beror på hur exakt (när det gäller signal till brus) korrelationsfunktionen kan mätas, vilket förklarar varför den inte begränsas av diffraktion. Således verkar det klart att den minsta förskjutningen som kan mätas beror på diffusiviteten hos objektet av intresse och den tidsmässiga upplösningen av bildinställningen.
I detta avseende är det viktigt att överväga att applicering på subcellulära nanostrukturer, såsom makropinosomer eller insulingranuler, med ett laserskanningsmikroskop är optimalt: den tillgängliga skanningshastigheten är signifikant högre än dynamiken hos objektet av intresse. I ett sådant fall är objektens rörelse under förvärvet försumbar, och korrelationsfunktionen kan approximeras med en Gaussisk funktion. Slutligen kan iMSD-metoden enkelt tillämpas på ett brett spektrum av kommersiella optiska mikroskopiinställningar baserade på rasterskanning eller kamerabaserad avbildning med brett fält, utan behov av systemkalibrering (krävs endast om en exakt uppskattning av partikelstorleken behöver uppnås). En viktig parameter för att metoden ska fungera är korrekt rumslig provtagning. För att uppnå en tillfredsställande konvergens av anpassningsalgoritmen bör den minsta storleken på det område som är av intresse för avbildning som en allmän regel vara minst tre gånger större än den maximala förskjutningen av intresse.
Sammanfattningsvis kräver iMSD-metoden endast ett mikroskop utrustat för snabb förvärv. Strukturen av intresse kan märkas till någon genetiskt kodad eller organisk fluorofor, vilket möjliggör flerkanalig avbildning. Det är tänkt att cross-iMSD-analys kommer att användas inom en snar framtid för att välja subpopulationer av subcellulära nanostrukturer och avslöja deras interaktioner och samdiffusion inom cellen, den senare är ett hett ämne inom cellulär biofysik. Om någon detalj går förlorad genom iMSD-analys är detta verkligen relaterat till den stora mängden molekylär information inom dynamiska subcellulära nanostrukturer. Sådan information beräknas oundvikligen i genomsnitt under mätningen på grund av dålig tidsupplösning. Teoretiskt sett finns det dock ingen teknisk gräns på grund av möjligheten att hämta molekylär information, förutsatt att tillräckliga förvärvshastigheter kan uppnås8. På grund av de kontinuerliga förbättringarna av detektorns hastighet / känslighet och bildteknik är det tänkt att information om hela det subcellulära facket och dess molekylära beståndsdelar kommer att extraheras från en enda dataset.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har fått finansiering från Europeiska forskningsrådet (ERC) inom ramen för EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 (bidragsavtal nr 866127, projekt CAPTUR3D).
100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Cell medium supplement |
C-peptide-EGFP | Plasmid | ||
DMEM High Glucose | Gibco | 31053028 | Cell medium (HeLa) |
FBS | Gibco | 10082147 | Cell medium supplement |
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma Aldrich | 46945-100MG-F | Reagent |
HeLa | ATCC | CCL-61 | Cell Line |
Lipofectamine 2000 | TermoFisher | 11668019 | Trasfection reagent |
Lysotracker Red DND-99 | Gibco | L7528 | Reagent |
Matlab | MathWork | Software | |
Microscope-suitable cell dishes | Willco | GWSt-3522 | Petri dishes |
Olympus FV1000 | Olympus Japan | Confocal microscope | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835063 | Cell medium (INS-1E) |