تحديد التفاعل الثلاثي بين اثنين من مونومرات من عامل النسخ MADS مربع وبروتين استشعار الكالسيوم من قبل BiFC-FRET-FLIM المقايسة
Summary
هنا نقدم، طريقة لتصور تشكيل معقدة الترنية بين ثلاثة شركاء البروتين باستخدام البروتينات الموسومة الفلورسنت من قبل BiFC مقرها FRET-FLIM المقايسة. هذه الطريقة قيمة لدراسة مجمعات التفاعل البروتين البروتين في الجسم الحي.
Abstract
التفاعلات البروتين البروتين هي جزء لا يتجزأ من جميع العمليات البيولوجية في الخلايا لأنها تلعب دورا حاسما في تنظيم وصيانة وتعديل الوظائف الخلوية. وتشارك هذه التفاعلات في مجموعة واسعة من الظواهر مثل نقل الإشارات، والاستجابة لمسببات الأمراض، والتفاعلات بين الخلايا الخلوية، والعمليات الأيضية والتنموية. وفي حالة عوامل النسخ، قد تؤدي هذه التفاعلات إلى احتكار الوحدات الفرعية، وعزلها في سياقات فرعية محددة مثل النواة والسيتوبلازم وما إلى ذلك، والتي بدورها قد يكون لها تأثير أكثر عمقا على التعبير عن جينات المصب. هنا، ونحن نظهر منهجية لتصور في التفاعل الثلاثي في الجسم الحي باستخدام استكمال الفلورية البيموليكية (BiFC) مقرها Förster الرنين نقل الطاقة (FRET) التي تنطوي على التصوير مدى الحياة الفلورية (FLIM). يتفاعل اثنان من البروتينات المختارة لهذه المظاهرة كشركاء BiFC ، ويستخدم نشاط الفلورسينس المعاد تشكيله لإجراء فحص FRET-FLIM مع الشريك الثالث. وقد استخدمت أربعة إلى خمسة أسابيع من العمر نمو غرفة نمت مصانع نيكوتيانا بنثاميانا كنظام مصنع نموذجي لهذا العرض التوضيحي.
Introduction
تشكل التفاعلات البروتينية البروتينية (PPIs) أساس الأداء السليم للخلايا النواة من خلال تنظيم مختلف العمليات الأيضية والتنموية. بعض PPIs مستقرة، في حين أن البعض الآخر عابر في طبيعته. يمكن تصنيف التفاعلات بناء على عدد الأعضاء ونوعهم في التفاعل مثل ثنائية، ثلاثية، ثلاثية الأرقام، رباعية الأرقام، وهيتيروميك1. قد يؤدي تحديد وتوصيف التفاعلات البروتينية إلى فهم أفضل لوظائف البروتين والشبكات التنظيمية.
عوامل النسخ هي البروتينات التي تشارك في الوظائف التنظيمية. وهي تنظم معدل نسخ جيناتها المصب عن طريق الربط بالحمض النووي. في بعض الأحيان oligomerization أو تشكيل مجمعات من الدرجة العالية عن طريق البروتينات هو شرط أساسي لتنفيذ وظائفهم2. عوامل النسخ مربع MADS النباتية هي الجينات المنزلية التي تنظم عمليات مختلفة مثل انتقال الأزهار، وتطوير الأعضاء الأزهار، والإخصاب، وتطوير البذور، والتألق، والتنمية النباتية. ومن المعروف أنها تشكل مجمعات أعلى ترتيبا التي ترتبط الحمض النووي3،4. دراسة شبكات PPI بين عوامل النسخ والمتفاعلين معها يوفر رؤى حول التعقيد الكامن وراء التنظيم النسخي.
تعبير البروتين العابر في نيكوتيانا بنثاميانا كان نهجا شائعا لدراسة توطين البروتين أو التفاعلات البروتين البروتين في الجسم الحي5. BiFC و FRET هي طرق لدراسة التفاعلات البروتين البروتين في الجسم الحي باستخدام أنظمة المراسل الفلورسنت6. وقد ثبت أن مزيجا من هاتين التقنيتين للكشف عن التفاعل بين ثلاثةبروتينات 7. يتم قياس FRET باستخدام تقنية acceptor photobleaching والانبعاثات الحساسة والتصوير مدى الحياة الفلوري (FLIM). وقد برز الفحص FRET القائم على FLIM كأداة توفر التحديد الكمي الدقيق وخصوصية الصدغية ملعقة لقياسات نقل الطاقة بين اثنين من الجزيئات على أساس العمر الفلوري8. يقيس FLIM الوقت الذي يبقى فيه الفلوروفور في حالة متحمسة قبل انبعاث الفوتون وهو أفضل من التقنيات التي تستخدمقياساتالكثافة وحدها 9و10. وإلى جانب أنظمة heterologous مثل نيكوتيانا بنثاميانا وقشور البشرة البصل، أظهرت تقارير أكثر حداثة استخدام جذور Arabidopsis والشتلات الأرز الشباب، وما إلى ذلك، لتحليل في الجسم الحي من التفاعلات البروتين البروتين في ظل الظروفالأصلية 11،12.
وبخلاف نظام التعبير المناسب، فإن اختيار الشركاء المتفاعلين في اختبارات BiFC و FRET أمر بالغ الأهمية لنجاح هذه التجربة. يجب التحقق من صحة مؤشر أسعار المنتجين بين الشركاء المستخدمين في تكوين BiFC باستخدام عناصر التحكم المناسبة قبل استخدامها كشريك مترافق في تجربة FRET13. يستخدم BiFC الاستكمال الهيكلي للأجزاء N-و C-terminal من البروتين الفلوري. كان القيد الشائع في معظم إن لم يكن كل البروتينات الفلورية المستخدمة في مقايسات BiFC هو التجميع الذاتي بين الشظايا المشتقة غير الفلورية ، مما يساهم في الفلورسنت الإيجابي الزائف ويقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء (S / N)14. التطورات الأخيرة، بما في ذلك الطفرات نقطة أو موقف تقسيم البروتين الفلورسنت، أدت إلى أزواج BiFC مع زيادة كثافة، وخصوصية أعلى، وارتفاع نسبة S / N15،16. ويمكن أيضا استخدام هذه البروتينات الفلورية لتنفيذ BiFC اعتمادا على مدى ملاءمة التجربة.
تقليديا، وقد استخدمت CFP وYFP كما المانحة والزوج المقبول في التجارب FRET17. ومع ذلك، تم العثور على YFP أو M-Citrine لتكون أفضل المتبرعين FRET (عند استخدامها مع RFP كمقبول) بسبب غلة الكم عالية (QY) خلال التعبير الأصلي من البروتينات المستهدفة في نظام الجذر Arabidopsis. كما يلعب اختيار المروجين (التأسيسيين مقابل الأصليين/المحليين) والفلوروفور دورا حاسما في تصميم تجربة ناجحة بين BiFC-FRET-FLIM. ومن الضروري ملاحظة أن كفاءة الجهات المانحة FRET ومدى ملاءمة أزواج FRET تميل إلى التغير مع التغيير في المروج والنظام البيولوجي المستخدم للتعبير. يعتمد QY للفلوروفور ، الذي يتعلق بسطوعه ، على درجة الحموضة ودرجة الحرارة والنظام البيولوجي قيد الاستخدام. نقترح أن يتم النظر في هذه المعايير بدقة قبل اختيار زوج الفلوروفور لتجربة FRET. النظام البيولوجي، والمروجين، والبروتينات المستخدمة لهذا البروتوكول عملت بشكل جيد مع الفلوروفوريس CFP-YFP لتجربة BIFC FRET-FLIM.
في هذه الدراسة، ونحن دمج ميزة FLIM لتصور التفاعل بين ثلاثة جزيئات البروتين باستخدام BIFC FRET مقرها. في هذه التقنية، يتم وضع علامة اثنين من البروتينات مع البروتين YFP الانقسام والبروتين الثالث مع CFP. منذ كنا مهتمين في دراسة التفاعل بين البروتين MADS مربع (M) homodimer مع بروتين استشعار الكالسيوم (C)، تم وضع علامات هذه البروتينات مع البروتينات الفلورية في pSITE-1CA وpSITE-3CA ناقلات18. اثنين من الشركاء التفاعل، في هذا المقايسة، تم وضع علامات مع N- و C-المحطة أجزاء من YFP في pSPYNE-35S وpSPYCE-35S ناقلات19،ونتائج تفاعلها في إعادة تشكيل YFP الوظيفية التي تعمل كمقبل FRET إلى الشريك التفاعل الثالث، الذي هو الموسومة مع CFP (بوصفها المانحة FRET) (الشكل 1 ). وفي هذه الحالة بالذات، تم التحقق من صحة مؤشر أسعار المنتجين بين اثنين من مونومرات M وبين M و C من خلال أداء BiFC في ثلاثة أنظمة مختلفة جنبا إلى جنب مع نظام الخميرة اثنين الهجين. وقد تم تعبئة هذه النواقل في سلالة Agrobacterium tumifaciens GV3101 عن طريق الكهرومporation. سلالة GV3101 لديه نزع سلاح تي بلازميد pMP90 (pTiC58DT-DNA) مع مقاومة جنتاميسين20. تمت إضافة سلالة البكتيريا الزراعية P19 جنبا إلى جنب مع جميع عمليات التسلل لمنع إسكات المتحولينجنسيا 21. نوصي بأن البروتينات الثلاثة يجب أن تستخدم أيضا في تشكيلات معاكسة للتحقق من صحة التفاعلات الثلاثية.
في هذه التقنية، قمنا بتوظيف FLIM، حيث أولا، يتم قياس عمر المضان للمتبرع (عمر المتبرع غير المروي) في غياب مقبول. بعد ذلك ، يتم قياس عمرها في وجود المقبول (عمر المتبرع المروي). يستخدم هذا الاختلاف في عمر الفلورسينس المانح لحساب كفاءة FRET ، والتي تعتمد على عدد الفوتونات التي تظهر انخفاضا في عمر الفلورية. المذكورة أدناه هو بروتوكول مفصل لتحديد تشكيل مجمع الترنية بين أي ثلاثة بروتينات من خلال التعبير عن عابر البروتينات الموسومة الفلورسنت في نيكوتيانا بنثاميانا وقول تفاعلها من قبل BiFC-FRET-FLIM.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويبين هذا البروتوكول استخدام المقايسة FRET-FLIM التي تستند إلى BIFC للتأكد من تكوين مجمع ترنيري بين مونومرين من بروتين MADS-box وبروتين مستشعر الكالسيوم. تم تكييف البروتوكول من تقرير من قبل Y. جون شيو وآخرون حيث طوروا طريقة FRET المستندة إلى BiFC لتصور المجمع الترنيمي الذي تم تشكيله بين heterodimers Fos-Jun و NFAT ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NB، GG، SB، KC أشكر بإخلاص لجنة المنح الجامعية (UGC)، UGC-BSR، DBT-INSPIRE، ومجلس البحوث العلمية والصناعية (CSIR) لزمالاتهم البحثية. ولحسن الحظ، نعترف بإدارة التكنولوجيا الأحيائية، وحكومة الهند، وإدارة العلوم والتكنولوجيا، وحكومة الهند، للحصول على الدعم المالي.
Materials
| 1 ml Syringes without needles | Dispovan | - | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Thermo Fischer Scientific | 11791020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Gentamycin Sulphate | Himedia | CMS461 | |
| Kanamycin Sulphate | Himedia | MB105 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Thermo Fischer Scientific | K240020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Phusion high fidelity Taq DNA polymerase | Thermo Fischer Scientific | F530-S | Any High fidelity Polymerase can work |
| Rifampicin | Himedia | CMS1889 | |
| SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope | Leica | SP8 FALCON | Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Himedia | TC034 |
References
- Grove, C. A., Walhout, A. J. M. Transcription factor functionality and transcription regulatory networks. Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).
- Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors. Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).
- Arora, R., et al. MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress. BMC Genomics. 8 (242), (2007).
- Theißen, G., Gramzow, L. Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors. Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).
- Schweiger, R., Schwenkert, S. Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).
- Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).
- Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. Combined bimolecular fluorescence complementation and förster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells. Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).
- Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
- Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1 (2020).
- Long, Y., et al. Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots. Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).
- Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants. Frontiers in Plant Science. , 11 (2020).
- Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
- Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).
- Kodama, Y., Hu, C. D. An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio. BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives. BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
- Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).
- Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).
- Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins. Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).
- Xie, X., et al. Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system. Nature Protocols. 16, (2021).
- Xu, J., et al. Optimized plasmid construction strategy for Cas9. Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).
- Mattanovich, D., et al. Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747 (1989).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).
- Tramier, M., et al. Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells. Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).
- Alvarez, L. A. J., et al. SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM. Nature Methods. 20, 2-4 (2019).
- Postma, M., Goedhart, J. Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries. PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).
- Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells. Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).
- Waadt, R., Kudla, J. In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).
