通过BiFC-FRET-FLIM测定MADS盒转录因子和钙传感器蛋白两种单体之间的三方相互作用

Summary

在这里，我们提出了一种通过基于BiFC的FRET-FLIM测定使用荧光标记蛋白可视化三元复合物形成的方法。该方法对于研究 体内蛋白质 – 蛋白质相互作用复合物很有价值。

Abstract

蛋白质 – 蛋白质相互作用是细胞中所有生物过程的组成部分，因为它们在调节，维持和修改细胞功能方面起着至关重要的作用。这些相互作用涉及广泛的现象，如信号转导，病原体反应，细胞 – 细胞相互作用，代谢和发育过程。在转录因子的情况下，这些相互作用可能导致亚基的寡聚化，在特定的亚细胞环境中隔离，如细胞核，细胞质等，这反过来又可能对下游基因的表达产生更深远的影响。在这里，我们展示了一种使用基于双分子荧光互补（BiFC）的Förster共振能量转移（FRET）可视化 体内 三方相互作用的方法，涉及荧光寿命成像（FLIM）。为本演示选择的两种蛋白质作为BiFC伙伴相互作用，并且它们重建的荧光活性用于与第三个伙伴测定FRET-FLIM。四到五周龄的生长室生长的 Nicotiana benthamiana 植物已被用作该演示的示范植物系统。

Introduction

蛋白质 – 蛋白质相互作用（PPI）通过调节各种代谢和发育过程，构成了真核细胞正常运作的基础。一些PPI是稳定的，而另一些则是瞬态的。相互作用可以根据相互作用中成员的数量和类型进行分类，例如二聚体，三聚体，四聚体同聚体和异构体^1。蛋白质相互作用的鉴定和表征可能导致对蛋白质功能和调节网络的更好理解。

转录因子是参与调节功能的蛋白质。它们通过与DNA结合来调节其下游基因的转录速率。有时蛋白质低聚或形成高阶复合物是执行其功能的先决条件^2。植物MADS盒转录因子是同源基因，调节各种过程，如花移，花器官发育，受精，种子发育，衰老和营养发育。已知它们形成与DNA^3，4结合的高阶复合物。研究转录因子及其相互作用者之间的PPI网络可以深入了解转录调控的复杂性。

Nicotiana benthamiana中的瞬时蛋白表达一直是研究体内蛋白质定位或蛋白质 – 蛋白质相互作用的流行方法^5。BiFC和FRET是使用荧光报告系统6在体内研究蛋白质 – 蛋白质相互作用^的方法。这两种技术的组合已被证明可以揭示三种蛋白质之间的相互作用^7。使用受体光漂白，敏化发射和荧光寿命成像（FLIM）技术测量FRET。基于FLIM的FRET测定已成为一种工具，可以根据其荧光寿命为两个分子之间的能量转移测量提供准确的定量和时空特异性⁸。FLIM测量荧光团在发射光子之前保持激发态的时间，并且比仅使用强度测量的技术更好^9，10。除了异源系统，如Nicotiana benthamiana和洋葱表皮皮，最近的报告已经证明使用拟南芥根和年轻的水稻幼苗等，在天然条件下进行蛋白质 – 蛋白质相互作用的体内分析11，12。

除了合适的表达系统外，选择用于BiFC和FRET测定的相互作用伙伴对于该实验的成功也至关重要。在使用FRET实验¹³中的共轭伙伴之前，应使用适当的对照来验证BiFC配置中使用的伙伴之间的PPI。BiFC利用荧光蛋白的N端和C端部分的结构互补。BiFC测定中使用的大多数（如果不是全部）荧光蛋白的一个共同限制是两个衍生的非荧光片段之间的自组装，导致假阳性荧光并降低信噪比（S /^N）14。最近的发展，包括点突变或分裂荧光蛋白的位置，已经产生了具有更高强度，更高特异性，高S / N比^15，16的BiFC对。这些荧光蛋白也可用于进行BiFC，具体取决于实验的适用性。

传统上，CFP和YFP在FRET实验¹⁷中被用作供体和受体对。然而，YFP或m-Citrine被发现是更好的FRET供体（当与RFP一起使用时作为受体使用时），因为在 拟南芥 根系中靶蛋白的天然表达过程中具有高量子产率（QY）。启动子（本构与天然/内源性）和荧光团的选择在设计成功的BiFC-FRET-FLIM实验中也起着至关重要的作用。必须注意的是，FRET供体的效率和FRET对的适宜性往往随着启动子和用于表达的生物系统的变化而变化。荧光团的QY与其亮度有关，取决于pH值，温度和使用的生物系统。我们建议在为FRET实验选择荧光团对之前彻底考虑这些标准。用于该方案的生物系统，启动子和蛋白质与CFP-YFP荧光团一起用于BiFC FRET-FLIM实验。

在本研究中，我们结合FLIM的特征，使用基于BiFC的FRET可视化三个蛋白质分子之间的相互作用。在该技术中，两种蛋白质用分裂的YFP蛋白标记，第三种蛋白质用CFP标记。由于我们有兴趣研究MADS盒蛋白（M）同源二聚体与钙传感器蛋白（C）的相互作用，因此这些蛋白在pSITE-1CA和pSITE-3CA载体¹⁸中用荧光蛋白标记。在该测定中，两个相互作用的伙伴在pSPYNE-35S和pSPYCE-35S载体¹⁹中用YFP的N端和C端部分标记，它们的相互作用导致功能YFP的重建，该功能YFP作为FRET受体到第三个相互作用伙伴，其用CFP标记（作为FRET供体）（图1）).在这种特殊情况下，两个M单体之间以及M和C之间的PPI已经通过在三个不同的系统中执行BiFC以及酵母双杂交系统进行了验证。这些载体通过电穿孔动员成 农杆菌Tumifaciens GV3101菌株。GV3101菌株具有解除武装的Ti质粒pMP90（pTiC58DT-DNA），具有庆大霉素耐药性^20。将p19 农杆菌 菌株与所有浸润一起加入，以防止转基因沉默^21。我们建议这三种蛋白质也应该以相反的构象使用，以验证三方相互作用。

在该技术中，我们采用了FLIM，其中首先，在没有受体的情况下测量供体的荧光寿命（未淬灭的供体寿命）。之后，在受体存在的情况下测量其寿命（淬灭供体寿命）。供体荧光寿命的这种差异用于计算FRET效率，这取决于荧光寿命缩短的光子数量。下面提到的是一个详细的方案，通过瞬时表达 Nicotiana benthamiana 中的荧光标记蛋白并通过BiFC-FRET-FLIM测定它们的相互作用来确定任何三元复合物之间三元复合物的形成。

Protocol

1. 入口和目的地载体中的基因克隆（图2） 通过PCR扩增目标基因（我们的例子中为M和C基因）的编码序列（CDS），并将其克隆到适当的入口载体（例如，pENTR / D-TOPO载体;有关本实验中使用的向量，请参见表1）。 在含有抗生素的平板上培养克隆。通过限制性消化和DNA测序验证在抗生素上选择的克隆22，23?…

Representative Results

该协议代表了研究植物 体内 三方蛋白质 – 蛋白质相互作用的优化方法。该协议的基本原理是结合两种荧光标记的蛋白质相互作用技术，即BiFC和FRET，以创建一种测定方法来测量三种蛋白质伴侣之间的三元复合物形成。在这里，我们使用FLIM来测量FRET供体伴侣在存在和不存在FRET受体的情况下的荧光寿命。如果两种蛋白质之间存在正相互作用，则预计供体的荧光寿命会缩短。我们从测量供体的…

Discussion

本方案展示了使用基于BiFC的FRET-FLIM测定来确定MADS盒蛋白和钙传感器蛋白的两个单体之间形成三元络合物。该协议改编自Y. John Shyu等人的一份报告，他们开发了一种基于BiFC的FRET方法，以可视化Fos-Jun异源二聚体和NFAT或p65之间形成的三元复合物，使用敏化发射方法^7。早些时候，Galperin和同事们在2004^年29年开发了一种三荧光团FRET系统，但它需要六个滤光片，其中包…

Materials

1 ml Syringes without needles	Dispovan	-
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406
Gateway  LR Clonase II Enzyme mix	Thermo Fischer Scientific	11791020	The vectors used in the study are Gateway based
Gentamycin Sulphate	Himedia	CMS461
Kanamycin Sulphate	Himedia	MB105
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M2933
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Thermo Fischer Scientific	K240020	The vectors used in the study are Gateway based
Phusion high fidelity Taq DNA polymerase	Thermo Fischer Scientific	F530-S	Any High fidelity Polymerase can work
Rifampicin	Himedia	CMS1889
SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope	Leica	SP8 FALCON	Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate	Himedia	TC034