קביעת אינטראקציה משולשת בין שני מונומרים של גורם שעתוק של קופסת MADS וחלבון חיישן סידן על ידי BiFC-FRET-FLIM Assay
Summary
כאן אנו מציגים, שיטה לדמיין היווצרות מורכבת טרנרית בין שלושה שותפי חלבון באמצעות חלבונים מתויגים פלואורסצנטית על ידי BiFC מבוסס FRET-FLIM assay. שיטה זו היא בעלת ערך לחקר מתחמי אינטראקציה בין חלבון חלבון ב- vivo.
Abstract
אינטראקציות בין חלבונים לחלבון הן חלק בלתי נפרד מכל התהליכים הביולוגיים בתאים, שכן הן ממלאות תפקיד מכריע בוויסות, תחזוקה ותיקון של תפקודי התא. אינטראקציות אלה מעורבות במגוון רחב של תופעות כגון העברת אותות, תגובת פתוגן, אינטראקציות בין תאים, תהליכים מטבוליים והתפתחותיים. במקרה של גורמי שעתוק, אינטראקציות אלה עשויות להוביל אוליגומריזציה של subunits, הפרדה בהקשרים תת-תאיים ספציפיים כגון הגרעין, ציטופלסמה, וכו ‘, אשר, בתורו, עשוי להיות השפעה עמוקה יותר על הביטוי של הגנים במורד הזרם. כאן, אנו מדגימים מתודולוגיה כדי לדמיין אינטראקציה משולשת vivo באמצעות השלמת פלואורסצנטיות דו-מולקולרית (BiFC) מבוסס Förster העברת אנרגיה תהודה (FRET) מעורבים הדמיה לכל החיים פלואורסצנטי (FLIM). שניים מהחלבונים שנבחרו להדגמה זו מתקשרים כשותפים של BiFC, ופעילות הפלואורסצנטיות המחודשת שלהם משמשת לבדיקת FRET-FLIM עם השותף השלישי. צמחים בני ארבעה עד חמישה שבועות בני 4 עד 5 שבועות של צמחים מגידול תאית ניקוטיאנה בנתמיאנה שימשו כמערכת הצמחים לדוגמה להדגמה זו.
Introduction
אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) מהווים את הבסיס לתפקוד תקין של התאים האוקריוטים על ידי ויסות תהליכים מטבוליים והתפתחותיים שונים. חלק מה- PPIs יציבים, בעוד שאחרים ארעיים בטבע. האינטראקציות עשויות להיות מסווגות בהתבסס על מספר וסוג החברים באינטראקציה כגון דימריק, טרימרי, הומומרי טטרמרי והטרומרי1. זיהוי ואפיון של אינטראקציות חלבון עשוי להוביל להבנה טובה יותר של פונקציות חלבון ורשתות רגולטוריות.
גורמי שעתוק הם חלבונים המעורבים בתפקודים רגולטוריים. הם מווסתים את קצב התמלול של הגנים במורד הזרם שלהם על ידי קשירה לדנ”א. לפעמים אוליגומריזציה או היווצרות של מתחמים מסדר גבוה יותר על ידי חלבונים הוא תנאי מוקדם לביצוע הפונקציות שלהם2. גורמי שעתוק של קופסת MADS הם גנים הומיאוטיים המווסתים תהליכים שונים כגון מעבר פרחוני, פיתוח איברים פרחוניים, הפריה, התפתחות זרעים, סנסנס והתפתחות וגטטיבית. הם ידועים ליצור מתחמים מסדר גבוה יותר אשר נקשרים ל- DNA3,4. לימוד רשתות PPI בין גורמי תמלול והאינטראקטיביות שלהם מספק תובנות לגבי המורכבות שבבסיס רגולציית התמלול.
ביטוי חלבון חולף בניקוטיאנה בנתמיאנה היה גישה פופולרית לחקר לוקליזציה של חלבונים או אינטראקציות חלבון-חלבון ב- vivo5. BiFC ו- FRET הן שיטות לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון ב- vivo באמצעות מערכות עיתונאי פלואורסצנטיות6. שילוב של שתי טכניקות אלה הוכח לחשוף את האינטראקציה בין שלושה חלבונים7. FRET נמדד באמצעות הדמיה מקבלת, פליטה רגישה וטכניקת הדמיה לכל החיים של פלואורסצנטיות (FLIM). בדיקת FRET מבוססת FLIM התפתחה ככלי המספק כימות מדויק וספציפיות מרחבית למדידות העברת אנרגיה בין שתי מולקולות המבוססות על אורך החיים הפלואורסצנטי שלהם8. FLIM מודד את הזמן פלואורופור נשאר במצב נרגש לפני פולט פוטון והוא טוב יותר מאשר טכניקות המשתמשות מדידות אינטנסיביות לבד9,10. מלבד מערכות הטרולוגיות כגון Nicotiana benthamiana וקליפות אפידרמיס בצל, דיווחים אחרונים הראו את השימוש בשורשים Arabidopsis ושתילי אורז צעירים, וכו ‘, לניתוח ויוו של אינטראקציות חלבון חלבון בתנאים מקומיים11,12.
מלבד מערכת ביטוי מתאימה, הבחירה של שותפים אינטראקציה עבור BiFC ו FRET גיוסים הוא גם חיוני להצלחת הניסוי הזה. יש לאמת את ה- PPI בין השותפים המשמשים בתצורת BiFC באמצעות פקדים מתאימים לפני השימוש בהם כשותף מצומד בניסוי FRET13. BiFC מנצל את ההשלמה המבנית של חלקים N-ו- C-מסוף של חלבון פלורסנט. מגבלה נפוצה ברוב החלבונים הפלואורסצנטיים המשמשים בבוחות BiFC הייתה ההרכבה העצמית בין שני שברים נגזרים שאינם פלואורסצנטיים, מה שתרם לפלורסצנטיות חיובית כוזבת ומקטין את יחס האות לרעש (S/N)14. התפתחויות אחרונות, כולל מוטציות נקודתיות או מיקום של פיצול חלבון פלואורסצנטי, הולידו זוגות BiFC עם עוצמה מוגברת, ספציפיות גבוהה יותר, יחס S / N גבוה15,16. חלבונים פלואורסצנטיים אלה יכולים לשמש גם לביצוע BiFC בהתאם להתאמת הניסוי.
באופן מסורתי, CFP ו- YFP שימשו כזוג התורם והמקבל בניסויי FRET17. עם זאת, YFP או m-Citrine נמצאו תורמי FRET טובים יותר (כאשר נעשה שימוש עם RFP כמקובל) בגלל התשואה הקוונטית הגבוהה (QY) במהלך הביטוי הטבעי של חלבוני היעד במערכת השורש Arabidopsis. הבחירה של מקדמים (מרכיב לעומת יליד / אנדוגני) פלואורופור גם לשחק תפקיד מכריע בעיצוב ניסוי BiFC-FRET-FLIM מוצלח. חשוב לציין כי היעילות של תורמי FRET והתאמתם של זוגות FRET נוטים להשתנות עם השינוי במקדם ובמערכת הביולוגית המשמשת לביטוי. ה- QY של הפלורופור, המתייחס לבהירותו, תלוי ב- pH, בטמפרטורה ובמערכת הביולוגית הנמצאת בשימוש. אנו מציעים כי קריטריונים אלה ישקלו ביסודיות לפני בחירת זוג פלואורופור לניסוי FRET. המערכת הביולוגית, היזמים והחלבונים המשמשים לפרוטוקול זה עבדו היטב עם פלואורופורים CFP-YFP לניסוי BiFC FRET-FLIM.
במחקר הנוכחי, אנו משלבים את התכונה של FLIM כדי לדמיין את האינטראקציה בין שלוש מולקולות חלבון באמצעות FRET מבוסס BiFC. בטכניקה זו, שני חלבונים מתויגים עם חלבון YFP מפוצל ואת החלבון השלישי עם CFP. מכיוון שהתעניינו בחקר האינטראקציה של הומודימר חלבון תיבת MADS (M) עם חלבון חיישן סידן (C), חלבונים אלה תויגו עם חלבונים פלואורסצנטיים בווקטורים pSITE-1CA ו- pSITE-3CA18. שניים מהשותפים לאינטראקציה, ב-assay זה, תויגו עם חלקים N-ו- C-terminal של YFP ב pSPYNE-35S ו- pSPYCE-35S וקטורים19, והאינטראקציה שלהם גורמת לחזרה של YFP פונקציונלי הפועל כקבל FRET לשותף האינטראקציה השלישי, אשר מתויג עם CFP (מתנהג כתורם FRET) (איור 1 ). במקרה מסוים זה, ה- PPI בין שני מונומרים M ובין M ו- C אומת על ידי ביצוע BiFC בשלוש מערכות שונות יחד עם מערכת שמרים-שתיים-היברידית. וקטורים אלה גויסו לתוך זן אגרובקטריום tumifaciens GV3101 על ידי אלקטרופורציה. זן GV3101 יש pMP90 טי מנוטרל (pTiC58DT-DNA) עם התנגדות גנטמיצין20. זן אגרובקטריום p19 נוסף יחד עם כל ההסתננויות כדי למנוע השתקת transgene21. אנו ממליצים כי שלושת החלבונים ישמשו גם בקונפורמציות הפוכות כדי לאמת את האינטראקציות המשולשות.
בטכניקה זו, השתמשנו FLIM, שבו הראשון, חיי הפלואורסצנטיות של התורם (חיים תורם ללא יראתי) נמדד בהיעדר מקבל. לאחר מכן, חייו נמדדים בנוכחות המקבל (אורך חיים של תורם מרווה). הבדל זה במאסרי החיים של פלואורסצנטיות התורם משמש לחישוב יעילות FRET, אשר תלוי במספר הפוטונים המציגים ירידה בחיי הפלואורסצנטיות. להלן פרוטוקול מפורט כדי לקבוע את היווצרותו של קומפלקס טרנרי בין כל שלושה חלבונים על ידי ביטוי חולף של חלבונים מתויגים פלואורסצנטית ב- Nicotiana benthamiana ו- assaying האינטראקציה שלהם על ידי BiFC-FRET-FLIM.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השימוש בבדיקת FRET-FLIM מבוססת BiFC כדי לברר את היווצרותו של קומפלקס טרנרי בין שני מונומרים של חלבון תיבת MADS וחלבון חיישן סידן. הפרוטוקול מותאם מדו”ח של Y. John Shyu et al. שבו הם פיתחו שיטת FRET מבוססת BiFC כדי לדמיין קומפלקס טרנרי שנוצר בין הטרודימרים פוס-יוני ו- NFAT או p65 בשיטת הפלי…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NB, GG, SB, KC מודים בכנות לוועדת המענקים של האוניברסיטה (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE והמועצה למחקר מדעי ותעשייתי (CSIR) על מלגות המחקר שלהם. למרבה המזל אנו מכירים במחלקה לביוטכנולוגיה (DBT), ממשלת הודו, המחלקה למדע וטכנולוגיה (DST-FIST), ממשלת הודו לתמיכה כספית.
Materials
| 1 ml Syringes without needles | Dispovan | - | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Thermo Fischer Scientific | 11791020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Gentamycin Sulphate | Himedia | CMS461 | |
| Kanamycin Sulphate | Himedia | MB105 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Thermo Fischer Scientific | K240020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Phusion high fidelity Taq DNA polymerase | Thermo Fischer Scientific | F530-S | Any High fidelity Polymerase can work |
| Rifampicin | Himedia | CMS1889 | |
| SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope | Leica | SP8 FALCON | Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Himedia | TC034 |
References
- Grove, C. A., Walhout, A. J. M. Transcription factor functionality and transcription regulatory networks. Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).
- Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors. Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).
- Arora, R., et al. MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress. BMC Genomics. 8 (242), (2007).
- Theißen, G., Gramzow, L. Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors. Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).
- Schweiger, R., Schwenkert, S. Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).
- Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).
- Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. Combined bimolecular fluorescence complementation and förster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells. Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).
- Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
- Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1 (2020).
- Long, Y., et al. Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots. Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).
- Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants. Frontiers in Plant Science. , 11 (2020).
- Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
- Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).
- Kodama, Y., Hu, C. D. An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio. BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives. BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
- Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).
- Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).
- Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins. Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).
- Xie, X., et al. Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system. Nature Protocols. 16, (2021).
- Xu, J., et al. Optimized plasmid construction strategy for Cas9. Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).
- Mattanovich, D., et al. Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747 (1989).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).
- Tramier, M., et al. Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells. Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).
- Alvarez, L. A. J., et al. SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM. Nature Methods. 20, 2-4 (2019).
- Postma, M., Goedhart, J. Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries. PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).
- Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells. Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).
- Waadt, R., Kudla, J. In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).
