एक MADS-बॉक्स ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर के दो मोनोमर और BiFC-FRET-FLIM परख द्वारा कैल्शियम सेंसर प्रोटीन के बीच त्रिपक्षीय बातचीत का निर्धारण
Summary
यहां हम प्रस्तुत करते हैं, BiFC आधारित FRET-FLIM परख द्वारा फ्लोरोसेंट-टैग प्रोटीन का उपयोग करके तीन प्रोटीन भागीदारों के बीच टर्नरी जटिल गठन की कल्पना करने के लिए एक विधि। यह विधि वीवो मेंप्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन कॉम्प्लेक्स का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान है।
Abstract
प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन कोशिकाओं में सभी जैविक प्रक्रियाओं का एक अभिन्न हिस्सा हैं क्योंकि वे सेलुलर कार्यों को विनियमित करने, बनाए रखने और संशोधित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। ये बातचीत सिग्नल ट्रांसडक्शन, रोगजनक प्रतिक्रिया, सेल-सेल इंटरैक्शन, मेटाबोलिक और विकासात्मक प्रक्रियाओं जैसी घटनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में शामिल हैं। प्रतिलेखन कारकों के मामले में, इन बातचीत से उपइकानों का अल्पाहारीकरण हो सकता है, विशिष्ट उपकोशिकीय संदर्भों जैसे नाभिक, साइटोप्लाज्म आदि में तनहा हो सकता है, जो बदले में, डाउनस्ट्रीम जीन की अभिव्यक्ति पर अधिक गहरा प्रभाव डाल सकता है। यहां, हम फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग (आईएफएल) से जुड़े द्विमेदीय फ्लोरेसेंस पूरक (बीएफसी) आधारित फैरस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरटी) का उपयोग करके वीवो त्रिपक्षीय बातचीत में कल्पना करने के लिए एक पद्धति प्रदर्शित करते हैं। इस प्रदर्शन के लिए चयनित प्रोटीन के दो BiFC भागीदारों के रूप में बातचीत, और उनके पुनर्गठित फ्लोरेसेंस गतिविधि तीसरे साथी के साथ FRET-FLIM परख करने के लिए प्रयोग किया जाता है । चार से पांच सप्ताह पुराने विकास-चैंबर में उगाए जाने वाले निकोटियाना बेंथामियाना पौधों को इस प्रदर्शन के लिए मॉडल प्लांट सिस्टम के रूप में इस्तेमाल किया गया है ।
Introduction
प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) विभिन्न मेटाबॉलिक और विकासात्मक प्रक्रियाओं को विनियमित करके यूकेरियोटिक कोशिकाओं के उचित कामकाज का आधार बनाते हैं। कुछ पीपीआई स्थिर हैं, जबकि अन्य प्रकृति में क्षणिक हैं। इंटरैक्शन को डिमेरिक, ट्राइमेरिक, टेट्रामेरिक होमोसेक्सुअल और हेट्रोमेरिक1जैसे इंटरैक्शन में सदस्यों की संख्या और प्रकार के आधार पर वर्गीकृत किया जा सकता है। प्रोटीन इंटरैक्शन की पहचान और लक्षण वर्णन से प्रोटीन कार्यों और नियामक नेटवर्क की बेहतर समझ हो सकती है।
प्रतिलेखन कारक प्रोटीन हैं जो नियामक कार्यों में शामिल हैं। वे डीएनए के लिए बाध्यकारी द्वारा अपने डाउनस्ट्रीम जीन के प्रतिलेखन की दर को विनियमित करते हैं । कभी-कभी प्रोटीन द्वारा उच्च क्रम के परिसरों का अल्पाधिकार या गठन उनके कार्यों को करने के लिए एक शर्त है2। प्लांट एमएड्स-बॉक्स ट्रांसक्रिप्शन कारक होमोटिक जीन हैं जो पुष्प संक्रमण, पुष्प अंग विकास, निषेचन, बीज विकास, सेनेसेंस और वनस्पति विकास जैसी विभिन्न प्रक्रियाओं को विनियमित करते हैं। वे उच्च क्रम परिसरों जो डीएनए3, 4से बांधने के लिए जानाजाताहै । ट्रांसक्रिप्शन कारकों और उनके इंटरएक्टिव के बीच पीपीआई नेटवर्क का अध्ययन करना ट्रांसक्रिप्शनल नियमन में अंतर्निहित जटिलता में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।
निकोटियाना बेंथामियाना में क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति वीवो5में प्रोटीन स्थानीयकरण या प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय दृष्टिकोण रहा है। BiFC और FRET फ्लोरोसेंट रिपोर्टर सिस्टम6का उपयोग कर वीवो में प्रोटीन प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के तरीके हैं । इन दोनों तकनीकों का संयोजन तीन प्रोटीन7के बीच बातचीत को प्रकट करने के लिए दिखाया गया है । FRET को स्वीकार्य फोटोब्लैचिंग, संवेदी उत्सर्जन, और फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग (एफबीम) तकनीक का उपयोग करके मापा जाता है। FLIM आधारित FRET परख एक उपकरण है कि उनके फ्लोरेसेंस जीवन काल 8 के आधार पर दो अणुओं के बीच ऊर्जा हस्तांतरण माप के लिए सटीक मात्राकरण और स्थानिक विशिष्टता प्रदान करता है के रूप मेंउभराहै । फ्लॉम उस समय का उपाय करता है जब एक फ्लोरोफोर फोटॉन उत्सर्जित करने से पहले उत्तेजित अवस्था में रहता है और यह तकनीकों से बेहतर होता है जो अकेले तीव्रता माप का उपयोग करते हैं9,10. निकोटियाना बेंथामियाना और प्याज एपिडर्मल छिलके जैसे विषम प्रणालियों के अलावा, हाल की रिपोर्टों में देशी परिस्थितियों11, 12के तहत प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के वीवो विश्लेषण में अरबीडोप्सिस जड़ों और युवा चावल रोपण आदि के उपयोग का प्रदर्शन किया गया है।
एक उपयुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली के अलावा, BiFC और FRET परख के लिए बातचीत भागीदारों का चयन भी इस प्रयोग की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है । बीआईएफसी विन्यास में उपयोग किए जाने वाले भागीदारों में पीपीआई को वीआइपी प्रयोग13में एक संयुग्मित भागीदार के रूप में उनके उपयोग से पहले उचित नियंत्रणों का उपयोग करके मान्य किया जाना चाहिए। बीएफसी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के एन-और सी-टर्मिनल भागों के संरचनात्मक पूरक का उपयोग करता है। सबसे में एक आम सीमा नहीं तो सभी फ्लोरोसेंट BiFC में इस्तेमाल प्रोटीन दो व्युत्पन्न nonfluorescent टुकड़े के बीच आत्म विधानसभा गया है, झूठी सकारात्मक फ्लोरेसेंस में योगदान और संकेत को शोर (एस/एन) अनुपात14कम हो जाती है । हाल के घटनाक्रमों में बिंदु उत्परिवर्तन या फ्लोरोसेंट प्रोटीन को विभाजित करने की स्थिति सहित, बढ़ी हुई तीव्रता, उच्च विशिष्टता, उच्च एस/एन अनुपात15,16के साथ BiFC जोड़े को जन्म दिया है । इन फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग प्रयोग की उपयुक्तता के आधार पर बीएफसी को बाहर ले जाने के लिए भी किया जा सकता है।
परंपरागत रूप से, सीएफपी और वाईएफपी का उपयोग एफर्टप्रयोगों 17में दाता और स्वीकारकर्ता जोड़ी के रूप में किया गया है। हालांकि, YFP या एम-सिट्रीन को अरबीडोप्सिस रूट सिस्टम में लक्षित प्रोटीन की देशी अभिव्यक्ति के दौरान उच्च क्वांटम यील्ड (क्यूवाई) के कारण बेहतर FRET दाताओं (जब स्वीकारकर्ता के रूप में आरएफपी के साथ उपयोग किया जाता है) पाया गया। प्रमोटरों का चयन (मूल/अंतर्जात बनाम संविलियन) और फ्लोरोफोर भी एक सफल बिएफसी-FRET-FLIM प्रयोग को डिजाइन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । यह ध्यान दें कि FRET दाताओं की दक्षता और FRET जोड़े की उपयुक्तता प्रमोटर में परिवर्तन और जैविक प्रणाली अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है के साथ बदल जाते है आवश्यक है । फ्लोरोफोर का क्यूवाई, जो इसकी चमक से संबंधित है, पीएच, तापमान और उपयोग में जैविक प्रणाली पर निर्भर करता है। हमारा सुझाव है कि FRET प्रयोग के लिए फ्लोरोफोर जोड़ी चुनने से पहले इन मानदंडों पर अच्छी तरह से विचार किया जाए। जैविक प्रणाली, प्रमोटरों, और इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल प्रोटीन BiFC FRET-FLIM प्रयोग के लिए CFP-YFP फ्लोरोफोरस के साथ अच्छी तरह से काम किया ।
वर्तमान अध्ययन में, हम BiFC आधारित FRET का उपयोग कर तीन प्रोटीन अणुओं के बीच बातचीत की कल्पना करने के लिए FLIM की सुविधा को शामिल करते हैं । इस तकनीक में दो प्रोटीन को स्प्लिट वाईएफपी प्रोटीन और तीसरा प्रोटीन सीएफपी के साथ टैग किया गया है। चूंकि हम कैल्शियम सेंसर प्रोटीन (सी) के साथ एक MADS-बॉक्स प्रोटीन (एम) होमोसैमर की बातचीत का अध्ययन करने में रुचि रखते थे, इसलिए इन प्रोटीनों को पीएसइट-1सीए और पीएसइट-3सीए वैक्टर18में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किया गया था। बातचीत भागीदारों में से दो, इस परख में, N के साथ टैग किया गया था और सी-PSPYNE-35S और pSPYCE-35S वैक्टर19में YFP के टर्मिनल भागों, और कार्यात्मक YFP के पुनर्गठन में उनकी बातचीत के परिणाम है कि तीसरे बातचीत साथी है, जो CFP के साथ टैग किया गया है (FRET दाता के रूप में अभिनय)(चित्रा 11 ). इस विशेष मामले में, दो एम मोनोमर और एम और सी के बीच पीपीआई को खमीर-दो-हाइब्रिड प्रणाली के साथ तीन विभिन्न प्रणालियों में बीआईएफसी प्रदर्शन करके मान्य किया गया है। इन वैक्टर को इलेक्ट्रोपाउरेशन द्वारा एग्रोबैक्टीरियम टुमिफैक्टियंस जीवी 3101 स्ट्रेन में जुटाया गया था। GV3101 तनाव एक निरस्त्र Ti plasmid pMP90 (pTiC58DT-डीएनए) gentamicin प्रतिरोध20के साथ है । ट्रांसजीन को रोकने के लिए सभी घुसपैठ के साथ – साथ पी19 एग्रोबैक्टीरियम स्ट्रेनजोड़ा गया था । हम अनुशंसा करते हैं कि त्रिपक्षीय बातचीत को मान्य करने के लिए तीन प्रोटीन का उपयोग विपरीत संरचनाओं में भी किया जाना चाहिए।
इस तकनीक में, हमने FLIM को नियोजित किया है, जहां पहले, दाता (अनकांपित दाता जीवनकाल) का फ्लोरेसेंस जीवनकाल एक स्वीकार्य व्यक्ति के अभाव में मापा जाता है। उसके बाद, इसका जीवनकाल स्वीकारकर्ता (शमन दाता जीवनभर) की उपस्थिति में मापा जाता है। दाता फ्लोरेसेंस लाइफटाइम में यह अंतर FRET दक्षता की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है, जो फ्लोरेसेंस जीवनकाल में कमी का प्रदर्शन करने वाले फोटॉनों की संख्या पर निर्भर करता है। नीचे उल्लिखित एक विस्तृत प्रोटोकॉल है जो निकोटियाना बेंथामियाना में फ्लोरोसेंट-टैग किए गए प्रोटीन को क्षणिक रूप से व्यक्त करके किसी भी तीन प्रोटीन के बीच एक टर्नरी परिसर के गठन का निर्धारण करता है और बिएफसी-एफआरटी-आईएफएम द्वारा उनकी बातचीत को परखता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल एक MADS-बॉक्स प्रोटीन और एक कैल्शियम सेंसर प्रोटीन के दो मोनोमर के बीच एक टर्नरी परिसर के गठन का पता लगाने के लिए BiFC आधारित FRET-FLIM परख के उपयोग को दर्शाता है । प्रोटोकॉल को वाई जॉन श्यो एट अल ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एनबी, जीजी, एसबी, केसी ने अपनी रिसर्च फेलोशिप के लिए यूनिवर्सिटी ग्रांट कमीशन (यूजीसी), यूजीसी-बीएसआर, डीबीटी-इंस्पायर और काउंसिल फॉर साइंटिफिक एंड इंडस्ट्रियल रिसर्च (सीएसआईआर) को ईमानदारी से धन्यवाद दिया । हम शुक्र है कि वित्तीय सहायता के लिए भारत सरकार के जैव प्रौद्योगिकी विभाग (डीबीटी), विज्ञान एवं प्रौद्योगिकी विभाग (डीएसटी-मुट्ठी), भारत सरकार को स्वीकार करते हैं ।
Materials
| 1 ml Syringes without needles | Dispovan | - | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Thermo Fischer Scientific | 11791020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Gentamycin Sulphate | Himedia | CMS461 | |
| Kanamycin Sulphate | Himedia | MB105 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Thermo Fischer Scientific | K240020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Phusion high fidelity Taq DNA polymerase | Thermo Fischer Scientific | F530-S | Any High fidelity Polymerase can work |
| Rifampicin | Himedia | CMS1889 | |
| SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope | Leica | SP8 FALCON | Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Himedia | TC034 |
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