BIFC-FRET-FLIMアッセイによるMADS型転写因子の2つのモノマーとカルシウムセンサタンパク質の三者間相互作用の測定
Summary
ここでは、BiFCベースのFRET-FLIMアッセイによる蛍光タグ付きタンパク質を用いた3つのタンパク質パートナー間の三元複合体形成を可視化する方法を提示する。この方法は、 生体内のタンパク質とタンパク質相互作用複合体を研究する上で有用である。
Abstract
タンパク質とタンパク質の相互作用は、細胞機能の調節、維持、および修正において重要な役割を果たす細胞内のすべての生物学的プロセスの不可欠な部分です。これらの相互作用は、シグナル伝達、病原体応答、細胞と細胞相互作用、代謝および発達過程などの幅広い現象に関与しています。転写因子の場合、これらの相互作用は、サブユニットのオリゴマー化、核、細胞質などの特定の細胞下の文脈での隔離を引き起こし、下流遺伝子の発現により深い影響を及ぼす可能性がある。ここでは、蛍光生涯イメージング(FLIM)を含む二分子蛍光相補(BiFC)ベースのフェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)を用いて 生体内 三者間相互作用を可視化する方法論を示す。このデモンストレーションのために選択された2つのタンパク質はBiFCパートナーとして相互作用し、その再構成された蛍光活性は第3のパートナーとのFRET-FLIMのアッセイに使用される。4~5週齢の成長室で栽培された ニコティアナ・ベンタミアナ 工場が、このデモンストレーションのモデルプラントシステムとして使用されています。
Introduction
タンパク質相互作用(PPI)は、様々な代謝および発達過程を調節することによって真核細胞の適切な機能の基礎を形成する。PPI の中には安定しているものもありますが、一時的な PPI もあります。相互作用は、異なる間、三量体、四量体同族体、ヘテロマー1などの相互作用におけるメンバーの数と種類に基づいて分類され得る。タンパク質相互作用の同定と特性評価は、タンパク質機能と調節ネットワークの理解を深める可能性があります。
転写因子は、調節機能に関与するタンパク質です。彼らはDNAに結合することによって下流遺伝子の転写速度を調節する。時にはタンパク質によるオリゴマー化または高次複合体の形成は、それらの機能を実行するための前提条件である2.植物MADSボックス転写因子は、花の転移、花の臓器の発達、受精、種子の発達、老化、栄養発達などの様々なプロセスを調節するホメオ遺伝子です。それらはDNA3,4に結合する高次複合体を形成することが知られている。転写因子とそのインターアクターの間でPPIネットワークを研究することは、転写調節の根底にある複雑さに関する洞察を提供する。
ニコチアナベンタミアナの一過性タンパク質発現は、生体内でタンパク質の局在化またはタンパク質とタンパク質の相互作用を研究する一般的なアプローチとなっています。BiFCとFRETは、蛍光レポーターシステム6を用いて生体内でタンパク質とタンパク質相互作用を研究するための方法である。これら2つの技術の組み合わせにより、3つのタンパク質7間の相互作用が明らかになったことが示されている。FRETはアクセクサフォトブリーチ、感作発光、蛍光寿命イメージング(FLIM)技術を用いて測定します。FLIMベースのFRETアッセイは、その蛍光寿命8に基づいて2つの分子間のエネルギー移動測定に正確な定量および時空間的特異性を提供するツールとして登場した。FLIMは、蛍光素が光子を放出する前に励起状態にとどまる時間を測定し、強度測定を単独で使用する技術よりも優れています9,10.ニコチアナベンタミアナやタマネギ表皮のような異種系のほかに、最近の報告では、シロイヌナズナや若い米の苗などの使用が実証されており、在来条件11,12の下でのタンパク質相互作用のインビボ解析に対して明示されている。
適切な発現系以外にも、BiFCおよびFRETアッセイの相互作用パートナーの選択も、この実験の成功にとって極めて重要である。BiFC 構成で使用されるパートナー間の PPI は、FRET 実験13で共役したパートナーとして使用する前に適切なコントロールを使用して検証する必要があります。BiFCは、蛍光タンパク質のN末端およびC末端部の構造的補引を利用する。BiFCアッセイで使用されるすべての蛍光タンパク質が2つの誘導非蛍光フラグメント間の自己集合性であったわけではない場合の最も一般的な制限は、2つの誘導性非蛍光フラグメント間の自己集合であり、偽陽性蛍光に寄与し、シグナル対雑音(S/N)比14を低下させる。最近の開発は、蛍光タンパク質を分割する点突然変異または位置を含む、強度の増加、特異性、高いS/N比15、16を有するBiFC対を生じさせた。これらの蛍光タンパク質は、実験の適性に応じてBiFCを実施するためにも使用できる。
従来、CFPとYFPは、FRET実験17においてドナー及びアクセプターペアとして使用されてきた。しかし、YFPまたはm-シトリンは、 シロイヌナズナ の根系における標的タンパク質の天然発現中の高い量子収率(QY)のために、より良いFRETドナー(アクセプターとしてRFPで使用される場合)であることが判明した。プロモーター(構成的対ネイティブ/内因性)およびフルオロフォアの選択は、BiFC-FRET-FLIM実験の成功を設計する上でも重要な役割を果たします。FRETドナーの効率とFRETペアの適合性は、発現に使用されるプロモーターおよび生物学的システムの変化に伴って変化する傾向があることに注意することが不可欠である。蛍光色素のQYは、その明るさに関連し、pH、温度、および使用中の生物学的システムに依存します。FRET実験用の蛍光素組を選択する前に、これらの基準を十分に考慮することを提案する。このプロトコルに使用される生物学的システム、プロモーター、およびタンパク質は、BiFC FRET-FLIM実験のためのCFP-YFPフルオロフォアとうまく機能しました。
本研究では、BiFCベースのFRETを用いて3つのタンパク質分子間の相互作用を可視化するFLIMの特徴を取り入れた。この技術では、2つのタンパク質が分割されたYFPタンパク質と3番目のタンパク質とCFPでタグ付けされます。MADS-boxタンパク質(M)ホモジマーとカルシウムセンサータンパク質(C)の相互作用を研究することに興味を持っていたので、これらのタンパク質はpSITE-1CAおよびpSITE-3CAベクター18において蛍光タンパク質でタグ付けされた。このアッセイでは、2人の相互作用パートナーが、pSPYNE-35SおよびpSPYCE-35Sベクトル19でYFPのNおよびC末端部分でタグ付けされ、その相互作用は、CFP(FRETドナーとして機能する)でタグ付けされた第3の相互作用パートナーにFRETアクセプターとして機能する機能的YFPの再構成をもたらす(図1).この特定の場合、2つのMモノマー間およびMとCの間のPPIは、酵母2ハイブリッド系と共に3つの異なるシステムでBiFCを行うことによって検証された。これらのベクターは、エレクトロポレーションにより アグロバクテリウム・トゥミファシエンス GV3101株に動員された。GV3101株は、ジェンタマイシン耐性20を有する武装解除されたTiプラスミドpMP90(pTiC58DT-DNA)を有する。p19 アグロバクテリウム 株は、遺伝子導入サイレンシング21を防ぐために、すべての浸潤と一緒に添加されました。三者間相互作用を検証するために、3つのタンパク質を反対の立体構造で使用することもお勧めします。
この技術では、まず、ドナーの蛍光寿命(非消痛ドナー生涯)がアクセプターの不在時に測定されるFLIMを採用した。その後、その寿命は、アクセンプター(クエンチドナー寿命)の存在下で測定される。このドナー蛍光寿命の差は、FRET効率の計算に使用され、これは蛍光寿命の減少を示す光子の数に依存する。以下に述べる詳細なプロトコルは、 ニコチアナベンタミ アナの蛍光タグ付きタンパク質を一時的に発現し、BiFC-FRET-FLIMによる相互作用をアッテルすることにより、任意の3つのタンパク質間の三元複合体の形成を決定する。
Protocol
Representative Results
Discussion
本プロトコルは、MADS-boxタンパク質とカルシウムセンサータンパク質の2つのモノマー間の三元複合体の形成を確認するためのBiFCベースのFRET-FLIMアッセイの使用を実証する。このプロトコルは、Y. John Shyuらのレポートから、感作放出法7を用いてFos-Junヘテロ二量体とNFATまたはp65の間に形成された三次複合体を可視化するBiFCベースのFRET法を開発したところから適応される。以?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NB, GG, SB, KCは、大学補助金委員会(UGC)、UGC-BSR、DBT-INSPIRE、科学産業研究評議会(CSIR)の研究フェローシップに心から感謝します。我々はありがたいことに、バイオテクノロジー省(DBT)、インド政府、科学技術省(DST-FIST)、インド政府の財政支援を認める。
Materials
| 1 ml Syringes without needles | Dispovan | - | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Thermo Fischer Scientific | 11791020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Gentamycin Sulphate | Himedia | CMS461 | |
| Kanamycin Sulphate | Himedia | MB105 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Thermo Fischer Scientific | K240020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Phusion high fidelity Taq DNA polymerase | Thermo Fischer Scientific | F530-S | Any High fidelity Polymerase can work |
| Rifampicin | Himedia | CMS1889 | |
| SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope | Leica | SP8 FALCON | Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Himedia | TC034 |
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