BIFC-FRET-FLIM 분석체에 의한 MADS 박스 전사 계수의 두 단백제와 칼슘 센서 단백질 간의 삼자 상호 작용 결정
Summary
여기서 우리는 BiFC 기반 FRET-FLIM 분석법에 의한 형광 태그 단백질을 사용하여 3개의 단백질 파트너 간의 삼차 복합 형성을 시각화하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 생체 내에서단백질 단백질 상호 작용 복합체를 연구하는 데 유용합니다.
Abstract
단백질 단백질 상호 작용은 세포 기능을 조절, 유지 및 수정하는 데 중요한 역할을 할 때 세포의 모든 생물학적 과정의 필수적인 부분입니다. 이러한 상호 작용은 신호 트랜스듀션, 병원체 반응, 세포 세포 상호 작용, 대사 및 발달 과정과 같은 광범위한 현상에 관여합니다. 전사 요인의 경우, 이러한 상호 작용은 핵, 세포질 등과 같은 특정 세포 외 맥락에서 분리된 하위 단위의 올리고머화로 이어질 수 있으며, 이는 차례로 다운스트림 유전자의 발현에 더 심오한 영향을 미칠 수 있다. 여기서는 형광 수명 이미징(FLIM)을 포함하는 이중 분자 형광 보완(BiFC) 기반 Förster 공명 에너지 전송(FRET)을 사용하여 생체 삼자 상호 작용을 시각화하는 방법론을 시연합니다. 이 데모를 위해 선택된 단백질의 2개는 BiFC 파트너로 상호 작용하고, 그들의 재구성한 형광 활동은 제 3 파트너와 FRET-FLIM를 분석하기 위하여 이용됩니다. 4~5주 된 성장 챔버 에서 자란 니코티아나 벤타미안나 식물은 이 데모의 모델 플랜트 시스템으로 사용되었습니다.
Introduction
단백질 단백질 상호 작용(PPI)은 다양한 대사 및 발달 과정을 조절하여 진핵 세포의 적절한 기능의 기초를 형성한다. 일부 PPI는 안정적이며 다른 PPI는 자연에서 일시적입니다. 상호 작용은 조광, 트리메릭, 테트라메릭 균동체 및 이종성1과같은 상호 작용에서 구성원의 수와 유형에 따라 분류될 수 있다. 단백질 상호 작용의 식별 및 특성화는 단백질 기능 및 규제 네트워크의 더 나은 이해로 이어질 수 있습니다.
전사 요인은 규제 기능에 관여하는 단백질입니다. 그(것)들은 DNA에 결합하여 그들의 다운스트림 유전자의 전사의 비율을 통제합니다. 때로는 단백질에 의한 고수 복합체의 올리고머화 또는 형성은 그들의 기능을 수행하기 위한 전제조건2. 식물 MADS 박스 전사 요인은 꽃 전환, 꽃 장기 발달, 수정, 종자 발달, 노화 및 식물 발달과 같은 다양한 과정을 조절하는 동종 유전자입니다. 그들은 DNA3에결합 하는 높은 순서 복합체를 형성 하는 것으로 알려져 있다3,4. 전사 요인과 그 상호 작용자 중 PPI 네트워크를 연구하면 기본 전사 규정의 복잡성에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
니코티아나 벤타미안나에서의 과도 단백질 발현은 생체 내에서단백질 국소화 또는 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 인기 있는 접근법이다5. BiFC 및 FRET는 형광 리포터 시스템6을사용하여 생체 내에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 방법이다. 이들 두 기술의 조합은 3개의 단백질7사이의 상호작용을 드러내는 것으로 나타났다. FRET는 수용조 광표백, 감감 방출 및 형광 평생 이미징(FLIM) 기술을 사용하여 측정됩니다. FLIM 기반 FRET 분석법은 형광 수명8을기준으로 두 분자 간의 에너지 전달 측정에 대한 정확한 정량화 및 현면 특이성을 제공하는 도구로 부상했다. FLIM은 광자 방출 전에 플루오로포어가 흥분된 상태로 머무르는 시간을 측정하며 강도 측정을 단독으로 사용하는 기술보다9,10이더 낫다. 니코티아나 벤타미안나 및 양파 표피 껍질과 같은 이종 시스템 외에도, 최근 보고서는 네이티브 조건 하에서 단백질-단백질 상호 작용의 생체 분석을 위해 아라비도시스 뿌리와 젊은 쌀 모종 등의 사용을입증했다11,12.
적절한 식 시스템 이외에 BiFC 및 FRET 에세이에 대한 상호 작용 파트너의 선택은 이 실험의 성공에 매우 중요합니다. BiFC 구성에 사용되는 파트너 간의 PPI는 FRET 실험13에서컨쥬게이션 파트너로 사용하기 전에 적절한 컨트롤을 사용하여 유효성을 검사해야 한다. BiFC는 형광 단백질의 N 및 C 단말 부분의 구조적 보완을 활용합니다. BiFC 분석서에 사용되는 모든 형광 단백질이 아닌 대부분의 일반적인 제한은 두 유도체 비형광 단편 간의 자체 조립으로, 거짓 양성 형광에 기여하고 신호-잡음(S/N)비율(14)을감소시한다. 최근 개발, 점 돌연변이 또는 형광 단백질분할의 위치를 포함하는, 증가 강도와 BiFC 쌍상승을 주었다, 높은 특이성, 높은 S/N 비율15,16. 이러한 형광성 단백질은 또한 실험의 적합성에 따라 BiFC를 수행하기 위해 사용될 수 있다.
전통적으로 CFP와 YFP는 FRET 실험17에서기증자 및 수용자 쌍으로 사용되어 왔다. 그러나, YFP 또는 m-Citrine은 애비독증 뿌리 시스템에서 표적 단백질의 원발현 동안 높은 양자 수율(QY)으로 인해 더 나은 FRET 기증자(RFP를 수용자로 사용할 경우)인 것으로 나타났다. 발기인(구성대 네이티브/내생)과 형광호는 성공적인 BiFC-FRET-FLIM 실험을 설계하는 데 중요한 역할을 합니다. FRET 기증자의 효율성과 FRET 쌍의 적합성은 발기인의 변화와 발현에 사용되는 생물학적 시스템의 변화와 함께 변화하는 경향이 있음을 주목하는 것이 필수적입니다. 그것의 밝기에 관련되는 불소호의 QY는, 사용 중인 pH, 온도 및 생물학 시스템에 달려 있습니다. FRET 실험을 위한 플루오로포레 쌍을 선택하기 전에 이러한 기준을 철저히 고려하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜에 사용되는 생물학적 시스템, 프로모터 및 단백질은 BiFC FRET-FLIM 실험을 위한 CFP-YFP 형광과 잘 작용했습니다.
본 연구에서는, 우리는 BiFC 기지를 둔 FRET를 사용하여 3개의 단백질 분자 사이 상호 작용을 구상하기 위하여 FLIM의 특징을 통합합니다. 이 기술에서, 2개의 단백질은 분할 YFP 단백질 및 CFP를 가진 세 번째 단백질로 태그됩니다. 우리는 칼슘 센서 단백질 (C)와 MADS 박스 단백질 (M) 호모이머의 상호 작용을 연구하는 데 관심이 있었기 때문에, 이러한 단백질은 pSITE-1CA 및 pSITE-3CA 벡터18에서형광 단백질로 태그되었다. 상호 작용 파트너 중 2개는 pSPYNE-35S 및 pSPYCE-35S 벡터19에서YFP의 N-및 C 단말 부분과 태그되었으며, 이들의 상호 작용은 CFP(FRET 기증자로 작용)와 태그되는 제3 상호작용 파트너에게 FRET 수락자 역할을 하는 기능성 YFP의 재구성(FRET 기증자의 경우)1(FRET 기증자의 역할)로 태그됩니다( FRET 기증자로 작용) (1) ). 이 경우, 두 M 단량체와 M과 C 사이의 PPI는 효모-2 하이브리드 시스템과 함께 세 가지 시스템에서 BiFC를 수행하여 검증되었습니다. 이러한 벡터는 전기화에 의해 Agrobacterium tumifaciens GV3101 균주로 동원되었다. GV3101 균주는 젠타미신저항(20)을가진 무장 해제 된 티 플라스미드 pMP90 (pTiC58DT-DNA)을 갖는다. p19 아그로박테리움 균주는 모든 침투와 함께 첨가되어 유전자침묵(21)을방지하였다. 3개의 단백질은 삼자 상호 작용을 확인하기 위하여 반대 순응에 이용되어야 한다는 것을 추천합니다.
이 기술에서, 우리는 FLIM를 채택했습니다, 여기서 첫째로, 기증자의 형광 수명 (불순종한 기증자 수명)는 수용자의 부재에서 측정됩니다. 그 후, 그 수명은 수용자의 존재에서 측정됩니다 (담금질 기증자 수명). 기증자 형광 수명에 있는 이 다름은 형광 수명에 있는 감소를 나타내는 광자의 수에 의존하는 FRET 효율성을 계산하기 위하여 이용됩니다. 아래에 언급된 상세한 프로토콜은 니코티아나 벤타미안에서 형광 태그 단백질을 일시적으로 표현하고 BiFC-FRET-FLIM에 의한 상호 작용을 말함으로써 어떤 3개의 단백질 사이 대동맥 복합체의 형성을 결정하기 위한 상세한 프로토콜입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 프로토콜은 MADS 박스 단백질의 두 단량체와 칼슘 센서 단백질 사이의 대동맥 복합체의 형성을 확인하기 위해 BiFC 기반 FRET-FLIM 분석의 사용을 보여줍니다. 이 프로토콜은 Y. John Shyu 등의 보고서에서 적용되어 Fos-Jun heterodimers와 NFAT 또는 p65 사이에 형성된 삼각 복합체를 민감하게 하여 7을 사용하여 시각화하는 BiFC 기반 FRET방법을개발하였다. 이전에는 2004년29년…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NB, GG, SB, KC는 대학 보조금 위원회 (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE, 과학 및 산업 연구위원회 (CSIR)의 연구 펠로우십에 진심으로 감사드립니다. 우리는 고맙게도 생명공학부 (DBT), 인도 정부, 과학 기술부 (DST-FIST), 재정 지원을 위한 인도 정부를 인정합니다.
Materials
| 1 ml Syringes without needles | Dispovan | - | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Thermo Fischer Scientific | 11791020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Gentamycin Sulphate | Himedia | CMS461 | |
| Kanamycin Sulphate | Himedia | MB105 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Thermo Fischer Scientific | K240020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Phusion high fidelity Taq DNA polymerase | Thermo Fischer Scientific | F530-S | Any High fidelity Polymerase can work |
| Rifampicin | Himedia | CMS1889 | |
| SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope | Leica | SP8 FALCON | Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Himedia | TC034 |
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