Determinação da interação tripartite entre dois monômeros de um fator de transcrição da caixa MADS e uma proteína de sensor de cálcio por Ensaio BiFC-FRET-FLIM
Summary
Aqui apresentamos, um método para visualizar a formação do complexo ternário entre três parceiros proteicos usando proteínas com marca fluorescente pelo ensaio FRET-FLIM baseado em BiFC. Este método é valioso para estudar complexos de interação proteína-proteína in vivo.
Abstract
As interações proteína-proteína são parte integrante de todos os processos biológicos das células, pois desempenham um papel crucial na regulação, manutenção e alteração das funções celulares. Essas interações estão envolvidas em uma ampla gama de fenômenos, como transdução de sinais, resposta de patógenos, interações célula-células, processos metabólicos e de desenvolvimento. No caso dos fatores de transcrição, essas interações podem levar à oligomerização de subunidades, sequestre em contextos subcelulares específicos como o núcleo, citoplasma, etc., que, por sua vez, podem ter um efeito mais profundo na expressão dos genes a jusante. Aqui, demonstramos uma metodologia para visualizar a interação tripartite in vivo usando a Complementação de Fluorescência Bimolecular (BiFC) baseada em Förster Resonance Energy Transfer (FRET) envolvendo Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Duas das proteínas selecionadas para esta demonstração interagem como parceiros do BiFC, e sua atividade de fluorescência reconstituída é usada para avaliar o FRET-FLIM com o terceiro parceiro. As plantas nicotiana benthamiana, cultivadas em quatro a cinco semanas, foram usadas como o sistema de plantas modelo para esta demonstração.
Introduction
As interações proteína-proteína (PPIs) formam a base do bom funcionamento das células eucarióticas regulando vários processos metabólicos e de desenvolvimento. Alguns PPIs são estáveis, enquanto outros são transitórios na natureza. As interações podem ser categorizadas com base no número e tipo de membros na interação, como dimeric, trimeric, tetramérrico homomédico e heteromérico1. A identificação e caracterização das interações proteicas pode levar a uma melhor compreensão das funções proteicas e das redes regulatórias.
Os fatores de transcrição são proteínas que estão envolvidas em funções regulatórias. Eles regulam a taxa de transcrição de seus genes a jusante ligando-se ao DNA. Às vezes, a oligomerização ou formação de complexos de alta ordem por proteínas é um pré-requisito para a realização de suas funções2. Os fatores de transcrição da caixa MADS são genes homeóticos que regulam vários processos como transição floral, desenvolvimento de órgãos florais, fertilização, desenvolvimento de sementes, senescência e desenvolvimento vegetativo. Eles são conhecidos por formar complexos de alta ordem que se ligam ao DNA3,4. Estudar as redes de PPI entre fatores de transcrição e seus interagirres fornece insights sobre a complexidade subjacente à regulação transcricional.
A expressão proteica transitória em Nicotiana benthamiana tem sido uma abordagem popular para estudar a localização de proteínas ou interações proteína-proteína in vivo5. BiFC e FRET são métodos para estudar interações proteína-proteína in vivo usando sistemas de repórteres fluorescentes6. Uma combinação dessas duas técnicas tem sido demonstrada para revelar a interação entre três proteínas7. O FRET é medido usando a técnica de fotobleaching aceitador, emissão sensibilizada e Fluorescência Lifetime Imaging (FLIM). O ensaio FRET baseado em FLIM surgiu como uma ferramenta que fornece quantificação precisa e especificidade espacial para medições de transferência de energia entre duas moléculas com base em suas vidas de fluorescência8. FLIM mede o tempo em que um fluorohore permanece em estado animado antes de emitir um fóton e é melhor do que técnicas que usam medidas de intensidadesozinhas 9,10. Além de sistemas heterologos como nicotiana benthamiana e cascas epidérmicas de cebola, relatórios mais recentes demonstraram o uso de raízes arabidopsis e mudas de arroz jovens, etc., para análise in vivo de interações proteína-proteína em condições nativas11,12.
Além de um sistema de expressão adequado, a seleção de parceiros interajantes para ensaios BiFC e FRET também é crucial para o sucesso deste experimento. O PPI entre os parceiros utilizados na configuração biFC deve ser validado utilizando controles apropriados antes de seu uso como parceiro conjugado no experimento FRET13. O BiFC utiliza a complementação estrutural das partes terminais N e C da proteína fluorescente. Uma limitação comum na maioria, se não todas as proteínas fluorescentes utilizadas nos ensaios biFC tem sido o auto-montagem entre os dois fragmentos não fluorescentes derivados, contribuindo para a fluorescência falso-positiva e diminui a razão sinal-ruído (S/N)razão 14. Desenvolvimentos recentes, incluindo mutações pontuais ou posição de divisão da proteína fluorescente, deram origem a pares de BiFC com maior intensidade, maior especificidade, alta razão S/N15,16. Essas proteínas fluorescentes também podem ser usadas para a realização de BiFC, dependendo da adequação do experimento.
Tradicionalmente, CFP e YFP têm sido usados como o doador e o par de aceitadores em experimentos FRET17. No entanto, YFP ou m-Citrine foram encontrados como melhores doadores de FRET (quando usados com RFP como aceitador) devido ao alto rendimento quântico (QY) durante a expressão nativa de proteínas-alvo no sistema raiz arabidopsis. A seleção de promotores (constitutivo versus nativo/endógeno) e fluorógono também desempenham um papel crucial na concepção de um experimento bifc-fret-flim bem sucedido. É essencial notar que a eficiência dos doadores de FRET e a adequação dos pares FRET tendem a mudar com a mudança no promotor e no sistema biológico que está sendo utilizado para a expressão. O QY do fluoróforo, que se relaciona com seu brilho, depende do pH, temperatura e do sistema biológico em uso. Sugerimos que esses critérios sejam cuidadosamente considerados antes de escolher o par fluoróforo para o experimento FRET. O sistema biológico, os promotores e as proteínas utilizadas para este protocolo funcionaram bem com fluoroforos CFP-YFP para o experimento BiFC FRET-FLIM.
No presente estudo, incorporamos a característica da FLIM para visualizar a interação entre três moléculas de proteínas utilizando FRET baseada em BiFC. Nesta técnica, duas proteínas são marcadas com proteína YFP dividida e a terceira proteína com PCP. Como estávamos interessados em estudar a interação de um homodimer de proteína mads-box (M) com uma proteína sensor de cálcio (C), essas proteínas foram marcadas com proteínas fluorescentes nos vetores pSITE-1CA e pSITE-3CA18. Dois dos parceiros interativos, neste ensaio, foram marcados com partes terminais N e C do YFP nos vetores pSPYNE-35S e pSPYCE-35S19, e sua interação resulta na reconstituição do YFP funcional que atua como um aceitador de FRET para o terceiro parceiro interagente, que é marcado com CFP (atuando como doador de FRET) (Figura 1 ). Neste caso específico, o PPI entre dois monômeros M e entre M e C foi validado realizando BiFC em três sistemas diferentes, juntamente com o sistema levedura-dois-híbridos. Esses vetores foram mobilizados na cepa Agrobacterium tumifaciens GV3101 por eletroporação. A cepa GV3101 tem um pMP90 de Ti plasmídeo desarmado (pTiC58DT-DNA) com resistência à gentamicina20. Uma cepa p19 Agrobacterium foi adicionada juntamente com todas as infiltrações para evitar o silenciamento transgene21. Recomendamos que as três proteínas também sejam usadas em conformações opostas para validar as interações tripartites.
Nesta técnica, utilizamos flim, onde primeiro, a vida fluorescência do doador (vida de doador nãonchado) é medida na ausência de um aceitor. Depois disso, sua vida útil é medida na presença do aceitador (extinto de vida do doador). Essa diferença na vida útil da fluorescência de doadores é usada para calcular a eficiência do FRET, que depende do número de fótons que apresentam uma redução na vida útil da fluorescência. Mencionado abaixo é um protocolo detalhado para determinar a formação de um complexo ternário entre quaisquer três proteínas expressando transitoriamente as proteínas fluorescentes marcadas em Nicotiana benthamiana e avaliando sua interação pelo BiFC-FRET-FLIM.
Protocol
Representative Results
Discussion
O presente protocolo demonstra o uso de ensaios FRET-FLIM baseados em BiFC para verificar a formação de um complexo ternário entre dois monômeros de uma proteína de caixa MADS e uma proteína de sensor de cálcio. O protocolo é adaptado a partir de um relatório de Y. John Shyu et al. onde eles desenvolveram um método FRET baseado em BiFC para visualizar complexo ternário formado entre heterodimers Fos-Jun e NFAT ou p65 usando o método de emissão sensibilizado7. Anteriormente, um sistema…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NB, GG, SB, KC agradecem sinceramente à Comissão de Subsídios Universitários (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE e Conselho de Pesquisa Científica e Industrial (CSIR) por suas bolsas de pesquisa. Agradecemos, felizmente, o Departamento de Biotecnologia (DBT), o Governo da Índia, o Departamento de Ciência e Tecnologia (DST-FIST), o Governo da Índia pelo apoio financeiro.
Materials
| 1 ml Syringes without needles | Dispovan | - | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Thermo Fischer Scientific | 11791020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Gentamycin Sulphate | Himedia | CMS461 | |
| Kanamycin Sulphate | Himedia | MB105 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Thermo Fischer Scientific | K240020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Phusion high fidelity Taq DNA polymerase | Thermo Fischer Scientific | F530-S | Any High fidelity Polymerase can work |
| Rifampicin | Himedia | CMS1889 | |
| SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope | Leica | SP8 FALCON | Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Himedia | TC034 |
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