הדמיה אופטית מזוסקופית של לב עכבר שלם
Summary
אנו מדווחים על שיטה לשחזור מזוסקופי של לב העכבר כולו על ידי שילוב של התקדמות חדשה בטרנספורמציה וצביעה של רקמות עם פיתוח של מיקרוסקופ אור סרוק אקסיאלי.
Abstract
מחלות לב גנטיות ולא גנטיות יכולות לגרום לתהליכי שיפוץ חמורים בלב. שיפוץ מבני, כגון תצהיר קולגן (פיברוזיס) ואי-התאמה תאית, יכול להשפיע על ההולכה החשמלית, לגרום להפרעות אלקטרומכניות, ובסופו של דבר להוביל להפרעות קצב. מודלי החיזוי הנוכחיים של שינויים פונקציונליים אלה מבוססים על מידע מבני לא משולב וברזולוציה נמוכה. הצבת מסגרת זו בסדר גודל שונה היא מאתגרת בשל חוסר היעילות של שיטות הדמיה סטנדרטיות בביצוע הדמיה ברזולוציה גבוהה ברקמה מסיבית. בעבודה זו אנו מתארים מסגרת מתודולוגית המאפשרת הדמיה של לבבות עכברים שלמים ברזולוציה מיקרומטרית. השגת מטרה זו דרשה מאמץ טכנולוגי שבו שולבו התקדמות בטרנספורמציה של רקמות ובשיטות הדמיה. ראשית, אנו מתארים פרוטוקול CLARITY אופטימלי המסוגל להפוך לב שלם לצורה ננו-נקבובית, היברידית הידרוג’ל, נטולת שומנים, המאפשרת שקיפות גבוהה וכתמים עמוקים. לאחר מכן, מתואר מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי המסוגל להשיג במהירות תמונות של שדה ראייה מזוסקופי (בקנה מידה מ”מ) ברזולוציה של קנה מידה מיקרוני. בעקבות פרויקט mesoSPIM, המיקרוסקופ שהגה מאפשר שחזור של כל לב העכבר ברזולוציה מיקרומטרית בסריקה טומוגרפית אחת. אנו מאמינים כי מסגרת מתודולוגית זו תאפשר להבהיר את מעורבותם של אי-סדר הציטו-ארכיטקטורה בתפקוד החשמלי ותסלול את הדרך למודל מקיף המתחשב הן בנתונים הפונקציונליים והן בנתונים המבניים, ובכך יאפשר חקירה מאוחדת של הגורמים המבניים המובילים לשינויים חשמליים ומכניים לאחר שיפוץ הרקמה.
Introduction
שיפוץ מבני הקשור למחלות לב יכול להשפיע על ההולכה החשמלית ולהכניס תפקוד אלקטרומכני של האיבר 1,2. הגישות הנוכחיות המשמשות לחיזוי שינויים תפקודיים משתמשות בדרך כלל ב-MRI וב-DT-MRI כדי לקבל שחזור כולל של תצהיר פיברוזיס, עץ כלי דם וחלוקת סיבים של הלב, והן משמשות למודלים של נתיבי התפשטות פוטנציאלית של פעולה מועדפת (APP) על פני האיבר 3,4. אסטרטגיות אלה יכולות לספק סקירה יפה של ארגון הלב. עם זאת, הרזולוציה המרחבית שלהם אינה מספיקה כדי לחקור את ההשפעה של שיפוץ מבני על תפקוד הלב ברמה התאית.
הצבת מסגרת זו בסדר גודל שונה, שבו תאים בודדים יכולים למלא תפקידים בודדים על התפשטות פוטנציאל פעולה, היא מאתגרת. המגבלה העיקרית היא חוסר היעילות של שיטות הדמיה סטנדרטיות לביצוע הדמיה ברזולוציה גבוהה (רזולוציה מיקרומטרית) ברקמות מסיביות (בגודל סנטימטר). למעשה, הדמיית רקמות ביולוגיות בתלת-ממד ברזולוציה גבוהה מסובכת מאוד בשל אטימות הרקמות. הגישה הנפוצה ביותר לביצוע שחזורים תלת-ממדיים באיברים שלמים היא להכין חתכים דקים. עם זאת, חיתוך, הרכבה והדמיה מדויקים דורשים מאמץ וזמן משמעותיים. גישה חלופית שאינה דורשת חיתוך הדגימה היא יצירת רקמה שקופה. במהלך השנים האחרונות, מספר מתודולוגיות להבהרת רקמות הוצעו 5,6,7,8. האתגר לייצר רקמות מסיביות, שקופות ומסומנות פלואורסצנטיות הושג לאחרונה על ידי פיתוח גישות טרנספורמציה אמיתיות של רקמות (CLARITY9, SHIELD10). בפרט, שיטת CLARITY מבוססת על הפיכת רקמה שלמה לצורה ננו-נקבובית, הידרו-היברידית, נטולת שומנים, המאפשרת להעניק שקיפות גבוהה על ידי הסרה סלקטיבית של דו-שכבתיות של שומנים בממברנה. יש לציין כי שיטה זו נמצאה מוצלחת גם בהכנה לבבית11,12,13,14. עם זאת, מכיוון שהלב שברירי מכדי להיות מתאים לניקוי אקטיבי, יש לנקות אותו באמצעות הגישה הפסיבית, הדורשת זמן רב כדי להעניק שקיפות מלאה.
בשילוב עם טכניקות הדמיה מתקדמות כמו מיקרוסקופיה של יריעות אור, ל-CLARITY יש פוטנציאל לצלם רקמות לב מסיביות בתלת-ממד ברזולוציה מיקרומטרית. במיקרוסקופיה של יריעות אור, הארת הדגימה מתבצעת עם יריעה דקה של אור המוגבלת במישור המוקד של מטרת האיתור. הפליטה הפלואורסצנטית נאספת לאורך ציר בניצב למישור התאורה15. ארכיטקטורת הגילוי דומה למיקרוסקופיית שדה רחב, מה שהופך את הרכישה למהירה הרבה יותר ממיקרוסקופים לסריקת לייזר. העברת הדגימה דרך יריעת האור מאפשרת קבלת טומוגרפיה מלאה של דגימות גדולות, עד דגימות בגודל סנטימטר. עם זאת, בשל התכונות הפנימיות של קרן גאוס, ניתן לקבל יריעת אור דקה מאוד (בסדר גודל של כמה מיקרונים) רק עבור הרחבה מרחבית מוגבלת, ובכך להגביל באופן דרסטי את שדה הראייה (FoV). לאחרונה הוצגה ערכת עירור חדשנית כדי להתגבר על מגבלה זו ולהחיל הדמיה מוחית, המאפשרת שחזורים תלת-ממדיים ברזולוציה איזוטרופית16.
במאמר זה מוצגת גישת סליקה פסיבית, המאפשרת הפחתה משמעותית של תזמון הסליקה הנדרש על ידי פרוטוקול CLARITY. המסגרת המתודולוגית המתוארת כאן מאפשרת לשחזר לב עכבר שלם ברזולוציה מיקרומטרית בסריקה טומוגרפית אחת עם זמן רכישה בסדר גודל של דקות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבודה זו הוצגה גישה מוצלחת לניקוי, הכתמה ותמונה של לב עכבר שלם ברזולוציה גבוהה. ראשית, פרוטוקול טרנספורמציה של רקמות (CLARITY) עבר אופטימיזציה ובוצע, שונה מעט ליישומו על רקמת הלב. ואכן, כדי להשיג שחזור יעיל בתלת מימד של לב שלם, חיוני למנוע את תופעת פיזור האור. מתודולוגיית CLARITY מאפשרת לנו להשיג ל…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם מענקים No 952166 (תיקון), MUR במסגרת תוכנית FISR, פרויקט FISR2019_00320 ו- Regione Toscana, הצדעה לבנדו רייסרקה 2018, פרויקט PERCARE.
Materials
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).
- Finocchiaro, G., et al. Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death. EP Europace. 2, 1-11 (2021).
- Bishop, M. J., et al. Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).
- Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation. IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist’s perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Park, Y. G., et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).
- Pianca, N., et al. Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery. The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).
- Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative – open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).
- Yi, F., et al. Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks. BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).
