マウス心臓全体のメゾスコピック光学イメージング
Summary
我々は、組織形質転換と染色の新たな進歩と軸走査型ライトシート顕微鏡の開発を組み合わせることにより、マウス心臓全体のメゾスコピック再構成法を報告する。
Abstract
遺伝性および非遺伝性の両方の心臓病は、心臓に重度のリモデリングプロセスを引き起こす可能性があります。コラーゲン沈着(線維症)や細胞のずれなどの構造リモデリングは、電気伝導に影響を及ぼし、電気機械的機能障害を引き起こし、最終的には不整脈を引き起こす可能性があります。これらの機能変化の現在の予測モデルは、統合されていない低解像度の構造情報に基づいています。このフレームワークを異なる桁数に配置することは、大規模な組織で高解像度イメージングを実行する際の標準的なイメージング方法の非効率性のために困難です。この研究では、マイクロメートル分解能でマウス心臓全体をイメージングできる方法論的フレームワークについて説明します。この目標を達成するには、組織形質転換とイメージング方法の進歩を組み合わせた技術的努力が必要でした。まず、無傷の心臓をナノポーラスでヒドロゲルハイブリダイズした脂質フリーの形態に変換できる最適化されたCLARITYプロトコルについて説明し、高い透明性と深い染色を可能にします。次に、ミクロンスケールの分解能でメゾスコピック視野(mmスケール)の画像を高速に取得できる蛍光光シート顕微鏡について説明する。mesoSPIMプロジェクトに続いて、考案された顕微鏡は、1回の断層撮影スキャンでマイクロメートル分解能でマウス心臓全体を再構築することを可能にします。この方法論的枠組みにより、電気機能障害における細胞構造の混乱の関与を明らかにし、機能データと構造データの両方を考慮した包括的なモデルへの道を開き、組織リモデリング後の電気的および機械的変化につながる構造的原因の統一的な調査が可能になると考えています。
Introduction
心疾患に関連する構造リモデリングは、電気伝導に影響を及ぼし、臓器の電気機械的機能障害を引き起こす可能性があります1,2。機能的変化を予測するために使用される現在のアプローチは、一般的にMRIおよびDT-MRIを使用して、心臓の線維症沈着、血管樹、および線維分布の全体的な再構成を取得し、それらは臓器を横切る優先活動電位伝播(APP)経路をモデル化するために使用されます3,4。これらの戦略は、心臓組織の美しい概要を提供することができます。しかし、それらの空間分解能は、細胞レベルでの心機能に対する構造リモデリングの影響を調べるには不十分です。
このフレームワークを、単一の細胞が活動電位の伝播において個々の役割を果たすことができる異なる桁に配置することは困難です。主な制限は、大規模な(センチメートルサイズの)組織で高解像度のイメージング(マイクロメートル分解能)を実行するための標準的なイメージング方法の非効率性です。実際、高解像度で3Dで生物学的組織をイメージングすることは、組織が不透明であるため非常に複雑です。臓器全体で3D再構成を実行するための最も一般的なアプローチは、薄い切片を準備することです。ただし、正確なセクショニング、組み立て、およびイメージングには、多大な労力と時間が必要です。サンプルを切断する必要のない別のアプローチは、透明な組織を生成することです。過去数年間、組織を透明化するためのいくつかの方法論が提案されてきた5、6、7、8。巨大で透明で蛍光標識された組織を製造するという課題は、真の組織形質転換アプローチ(CLARITY9、SHIELD10)を開発することによって最近達成されました。特に、CLARITY法は、無傷の組織をナノポーラスのヒドロゲルハイブリダイズした脂質フリー形態に変換することに基づいており、膜脂質二重層の選択的除去によって高い透明性を付与することができます。注目すべきことに、この方法は心臓調製物においても成功していることが見出されている11、12、13、14。ただし、心臓は脆弱すぎて能動的な清算には適さないため、受動的なアプローチを使用して清算する必要があり、完全な透明性を付与するには長い時間がかかります。
ライトシート顕微鏡などの高度なイメージング技術と組み合わせることで、CLARITYはマイクロメートルの解像度で3Dの巨大な心臓組織をイメージングする可能性があります。ライトシート顕微鏡では、サンプルの照明は、検出対物レンズの焦点面に閉じ込められた薄いシートの光で行われます。蛍光発光は、照明面15に垂直な軸に沿って収集される。検出アーキテクチャは広視野顕微鏡に似ており、レーザー走査型顕微鏡よりもはるかに高速に取得できます。ライトシートを通してサンプルを移動することで、センチメートルサイズまでの大きな標本の完全な断層撮影が可能になります。しかしながら、ガウシアンビームの本質的な性質のために、限られた空間拡張のためだけに非常に薄い(数ミクロンのオーダーの)ライトシートを得ることが可能であり、したがって視野(FoV)を大幅に制限する。最近、この制限を克服するために新しい励起スキームが導入され、脳イメージングに適用され、等方性分解能16の3D再構成が可能になりました。
この論文では、パッシブクリアリングアプローチを提示し、CLARITYプロトコルに必要なクリアリングタイミングを大幅に短縮できるようにします。ここで説明する方法論的枠組みは、分オーダーの取得時間を有する単一の断層撮影スキャンにおいて、マイクロメートル分解能でマウス心臓全体を再構築することを可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究では、マウスの心臓全体を高解像度でクリア、染色、および画像化するアプローチの成功を紹介しました。まず、組織形質転換プロトコル(CLARITY)を最適化して実行し、心臓組織への適用のためにわずかに変更しました。実際、心臓全体の3次元で効率的な再構成を得るためには、光散乱の現象を防ぐことが不可欠です。CLARITYの方法論により、透明度の高い無傷の心臓を得ることがで?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、助成金契約第952166号(REPAIR)に基づく欧州連合のホライズン2020研究およびイノベーションプログラム、FISRプログラムに基づくMUR、プロジェクトFISR2019_00320およびトスカーナ地域、バンドーリセルカ敬礼2018、PERCAREプロジェクトから資金提供を受けています。
Materials
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
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