Imaging ottico mesoscopico dell'intero cuore del topo
Summary
Riportiamo un metodo per la ricostruzione mesoscopica dell’intero cuore del topo combinando nuovi progressi nella trasformazione e colorazione dei tessuti con lo sviluppo di un microscopio a foglio di luce a scansione assiale.
Abstract
Sia le malattie cardiache genetiche che quelle non genetiche possono causare gravi processi di rimodellamento nel cuore. Il rimodellamento strutturale, come la deposizione di collagene (fibrosi) e il disallineamento cellulare, può influenzare la conduzione elettrica, introdurre disfunzioni elettromeccaniche e, infine, portare ad aritmia. Gli attuali modelli predittivi di queste alterazioni funzionali si basano su informazioni strutturali non integrate e a bassa risoluzione. Collocare questo quadro su un diverso ordine di grandezza è difficile a causa dell’inefficacia dei metodi di imaging standard nell’esecuzione di immagini ad alta risoluzione in tessuti massicci. In questo lavoro, descriviamo un quadro metodologico che consente l’imaging di interi cuori di topo con risoluzione micrometrica. Il raggiungimento di questo obiettivo ha richiesto uno sforzo tecnologico in cui sono stati combinati i progressi nella trasformazione dei tessuti e nei metodi di imaging. In primo luogo, descriviamo un protocollo CLARITY ottimizzato in grado di trasformare un cuore intatto in una forma nanoporosa, ibridata con idrogel e priva di lipidi che consente un’elevata trasparenza e una colorazione profonda. Quindi, viene descritto un microscopio a foglio di luce a fluorescenza in grado di acquisire rapidamente immagini di un campo visivo mesoscopico (scala mm) con la risoluzione su scala micron. A seguito del progetto mesoSPIM, il microscopio concepito permette la ricostruzione dell’intero cuore del topo con risoluzione micrometrica in un’unica scansione tomografica. Riteniamo che questo quadro metodologico consentirà di chiarire il coinvolgimento del disordine citoarchitettonico nelle disfunzioni elettriche e aprirà la strada a un modello completo che consideri sia i dati funzionali che strutturali, consentendo così un’indagine unificata delle cause strutturali che portano ad alterazioni elettriche e meccaniche dopo il rimodellamento tissutale.
Introduction
Il rimodellamento strutturale associato a malattie cardiache può influenzare la conduzione elettrica e introdurre disfunzioni elettromeccaniche dell’organo 1,2. Gli attuali approcci utilizzati per prevedere le alterazioni funzionali impiegano comunemente MRI e DT-MRI per ottenere una ricostruzione complessiva della deposizione di fibrosi, dell’albero vascolare e della distribuzione delle fibre del cuore e sono utilizzati per modellare percorsi di propagazione del potenziale di azione preferenziale (APP) attraverso l’organo 3,4. Queste strategie possono fornire una bella panoramica dell’organizzazione del cuore. Tuttavia, la loro risoluzione spaziale è insufficiente per studiare l’impatto del rimodellamento strutturale sulla funzione cardiaca a livello cellulare.
Collocare questo quadro a un diverso ordine di grandezza, in cui le singole cellule possono svolgere ruoli individuali sulla propagazione del potenziale d’azione, è impegnativo. La limitazione principale è l’inefficienza dei metodi di imaging standard per eseguire immagini ad alta risoluzione (risoluzione micrometrica) in tessuti massicci (centimetrici). In effetti, l’imaging dei tessuti biologici in 3D ad alta risoluzione è molto complicato a causa dell’opacità dei tessuti. L’approccio più comune per eseguire ricostruzioni 3D in interi organi è quello di preparare sezioni sottili. Tuttavia, il sezionamento, l’assemblaggio e l’imaging precisi richiedono uno sforzo e un tempo significativi. Un approccio alternativo che non richiede il taglio del campione è quello di generare un tessuto trasparente. Negli ultimi anni sono state proposte diverse metodologie per la chiarificazione dei tessuti 5,6,7,8. La sfida di produrre tessuti massicci, trasparenti e marcati con fluorescenza è stata recentemente raggiunta sviluppando veri approcci di trasformazione tissutale (CLARITY9, SHIELD10). In particolare, il metodo CLARITY si basa sulla trasformazione di un tessuto intatto in una forma nanoporosa, ibridata con idrogel, priva di lipidi che consente di conferire un’elevata trasparenza mediante la rimozione selettiva dei doppi strati lipidici di membrana. In particolare, questo metodo è stato trovato efficace anche nella preparazione cardiaca11,12,13,14. Tuttavia, poiché il cuore è troppo fragile per essere adatto a una compensazione attiva, deve essere eliminato utilizzando l’approccio passivo, che richiede molto tempo per conferire completa trasparenza.
In combinazione con tecniche di imaging avanzate come la microscopia a foglio di luce, CLARITY ha il potenziale per visualizzare tessuti cardiaci massicci 3D a risoluzione micrometrica. Nella microscopia a foglio di luce, l’illuminazione del campione viene eseguita con un sottile foglio di luce confinato nel piano focale dell’obiettivo di rilevamento. L’emissione di fluorescenza viene raccolta lungo un asse perpendicolare al piano di illuminazione15. L’architettura di rilevamento è simile alla microscopia a campo largo, rendendo l’acquisizione molto più veloce rispetto ai microscopi a scansione laser. Lo spostamento del campione attraverso il foglio luminoso consente di ottenere una tomografia completa di campioni di grandi dimensioni, fino a campioni di dimensioni centimetriche. Tuttavia, a causa delle proprietà intrinseche del fascio gaussiano è possibile ottenere un foglio di luce molto sottile (dell’ordine di pochi micron) solo per una limitata estensione spaziale, limitando così drasticamente il campo visivo (FoV). Recentemente, è stato introdotto un nuovo schema di eccitazione per superare questa limitazione e applicato per l’imaging cerebrale, consentendo ricostruzioni 3d con risoluzione isotropa16.
In questo documento, viene presentato un approccio di compensazione passiva, che consente una significativa riduzione dei tempi di compensazione necessari per il protocollo CLARITY. Il quadro metodologico qui descritto permette di ricostruire un cuore intero di topo con risoluzione micrometrica in un’unica scansione tomografica con un tempo di acquisizione nell’ordine dei minuti.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo lavoro, è stato introdotto un approccio di successo per chiarire, colorare e visualizzare un intero cuore di topo ad alta risoluzione. In primo luogo, è stato ottimizzato ed eseguito un protocollo di trasformazione tissutale (CLARITY), leggermente modificato per la sua applicazione sul tessuto cardiaco. Infatti, per ottenere un’efficace ricostruzione in 3D di un cuore intero, è fondamentale prevenire il fenomeno della diffusione della luce. La metodologia CLARITY ci permette di ottenere un cuore intatto alta…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell’Unione Europea nell’ambito della convenzione di sovvenzione n. 952166 (REPAIR), MUR nell’ambito del programma FISR, progetto FISR2019_00320 e Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, progetto PERCARE.
Materials
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
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