Zebrafisk blastoderm explants genereres ved at isolere embryonale celler fra endogene signalcentre i det tidlige embryo, der producerer relativt naive celle klynger let manipuleret og kultiveret ex vivo. Denne artikel indeholder instruktioner til fremstilling af sådanne explants og demonstrerer deres nytte ved at forhøre roller for Nodal signalering under gastrulation.
På grund af deres optiske klarhed og hurtige udvikling er zebrafiskembryoner et fremragende system til undersøgelse af celleadfærd og udviklingsprocesser. Men på grund af kompleksiteten og redundansen af embryonale signaler kan det være udfordrende at skelne den komplette rolle af et enkelt signal under tidlig embryogenese. Ved at eksplante dyreregionen af zebrafisk blastoderm genereres relativt naive klynger af embryonale celler, der let kan dyrkes og manipuleres ex vivo. Ved at indføre et gen af interesse ved RNA injektion før explantation, kan man vurdere effekten af dette molekyle på genekspression, celle adfærd, og andre udviklingsmæssige processer i relativ isolation. Desuden kan celler fra embryoner af forskellige genotyper eller tilstande kombineres i en enkelt kimær explant for at undersøge celle /vævsinteraktioner og vævsspecifikke genfunktioner. Denne artikel indeholder instruktioner til generering af zebrafisk blastoderm explants og viser, at et enkelt signalmolekyle – en Nodal ligand – er tilstrækkelig til at fremkalde kimlag dannelse og udvidelse morfogenese i ellers naive embryonale væv. På grund af deres evne til at generobre embryonale celle adfærd, morfogen gradienter, og genekspression mønstre i en forenklet ex vivo system, disse explants forventes at være af stor nytte for mange zebrafisk forskere.
Et flerårigt mål for udviklingsbiologiområdet er at optrævle kompleksiteten af at udvikle embryoner for at forstå oprindelsen af dyrs form og funktion. Selv tidlige embryoner indeholder et komplekst medley af signalmolekyler, celle- og vævsinteraktioner og mekaniske kræfter, der alle er underlagt streng rumlig og tidsmæssig regulering. Derfor er det ofte en udfordring at udpege den præcise rolle, som et bestemt signal spiller i en udviklingsproces af interesse. Ved at fjerne embryonale væv fra deres endogene miljø skaber embryo explantation en forenklet platform til at skelne de enkelte vævs og molekylers udviklingsroller i relativ isolation. Eksplantation teknikker er måske bedst kendt i Xenopus laevis, hvor de er blevet brugt til at studere væv induktion, celle signalering, celle vedhæftning, og morfogenese, blandt andre processer1,2,3,4. Såkaldte dyrehætte explants, hvor dyreregionen blastula fase Xenopus embryoner er isoleret før induktive interaktioner5,6,7, er en udbredt og kraftfuld explant teknik. Unmanipulated dyrehætter er skæbnebestemt til at blive ectoderm7,8. Alligevel er de kompetente til at reagere på flere induktive faktorer, så de kan danne væv af alle tre kimlag og gennemgå vævssvarende morfogenetiske bevægelser9,10,11. Begrænsede genetiske værktøjer og suboptimal egnethed til levende billeddannelse forhindrer imidlertid brugen af Xenopus dyrehætte explants for mange udviklingsbiologer. Ved at explanting blastoderm celler fra zebrafisk embryoner, kan forskerne kombinere nytten af dyrehætte assay med optisk klarhed, overflod af genetiske værktøjer, og andre eksperimentelle fordele ved zebrafisk model system.
Til dato har forskere gjort brug af to varianter af zebrafisk explants: såkaldte pescoids og blastoderm explants. I den pescoid model, hele blastoderm, herunder den marginale zone, er isoleret fra æggeblommen og lov til at udvikle ex vivo uden extraembryonic æggeblomme syncytial lag (YSL)12,13. På denne måde har pescoids en bemærkelsesværdig lighed med Fundulus explants genereret årtier siden af Jane Oppenheimer og JP Trinkaus14,15. Disse explants rekapitulere mange aspekter af embryonale mønstre og morfogenese12,13. Men fordi disse isolater indeholder endogene signalcentre (den embryonale margen), er de ikke forenklet med hensyn til deres molekylære miljø. Alternativt kan forskere generere relativt naive zebrafisk blastoderm explants ved at udelukke marginal zone16,17,18,19,20,21. Unmanipulated zebrafisk blastoderm explants udtrykke høje niveauer af knogle morfogenetisk protein (BMP) morfogener19 og give anledning til ikke-neurale ectoderm og omsluttende lag (EVL) når kultiveret ex vivo18. Men de rekapitulerer mange aspekter af aksial mønster og morfogenese som reaktion på udefrakommende signalgradienter19,20,21, svarende til Xenopus dyrehætter. Af denne grund er blastoderm explants en fordelagtig model til at studere en given morfogens (eller morfogener) rolle i kimlagspecifikation, morfogenetiske cellebevægelser og signaleringsgradienter inden for et forenklet signalmiljø. Desuden kan blastodermer fra embryoner af forskellige genotyper eller tilstande kombineres i en enkelt kimær explant19,21 for at undersøge celle / væv autonomi og induktive interaktioner.
Zebrafisk blastoderm explants kan bruges til at undersøge den rolle, embryonale signaler (for eksempel Nodal) i morfogenese og væv specifikation under gastrulation. Ved at injicere syntetisk ndr2 RNA (kodning af en Nodal ligand) på encellet fase aktiveres Nodal-signalering i hele embryoets blastoderm. Explants fra disse embryoner generere Nodal signalering gradienter, danne alle tre kim lag, og gennemgå konvergens og udvidelse (C &E) gastrulation bevægelser som set i intakte embryoner20. Derudover bruges kimær explants til at illustrere mesodermvævs evne til at fremkalde neuroectoderm fra uinjectederede (naive) blastoderm. Denne protokol giver instruktioner til at skabe zebrafisk blastoderm explants og viser deres nytte i at definere den rolle, Nodal signalering i væv induktion og morfogenese.
Denne artikel har beskrevet, hvordan man genererer zebrafisk blastoderm explants og drøftet to praktiske anvendelser af disse explants i behandlingen af den rolle Nodal morfogen signalering i gastrulation. Denne metode til skæring og dyrkning af explants giver en blank skifer af naive celler, der kan manipuleres ved hjælp af RNA injektioner og behandling med små molekyle forbindelser til at undersøge en molekylær vej af interesse.
Kritiske skridt
Der er fire trin i denne protokol, der er særligt afgørende for dens succes. Den første er at injicere embryonerne med den passende mængde Nodal. Denne protokol anbefaler 10 pg ndr2 RNA, og selv om en række doser fremmer forlængelse, for meget eller for lidt Nodal vil forhindre optimal explant udvidelse20. Det andet skridt er at dechorionating embryonerne. Hvis embryonerne forbliver i pronase for længe, vil æggeblommerne briste, og embryonerne vil ikke være levedygtige at skære. Hvis de ikke er i pronase længe nok, chorions vil ikke blive løsnet ved vask og vil i stedet kræve tidskrævende manuel dechorionation. Det tredje kritiske skridt er at skære explants. Skæring i 3x Danieaus opløsning anbefales, da det lavere saltindhold i 0,3x Danieaus opløsning eller æggevand ikke fremmer heling og overlevelse af explants.
Derudover skal explants skæres på ca. halvdelen af højden af blastoderm for at sikre naivitet af cellerne. Hvis de skæres for tæt på æggeblommen, vil de indeholde signaler fra margenen (herunder endogene Nodal), der fremmer vævsspecifikation og morfogenese. Det fjerde og sidste kritiske skridt er i helbredelsen af kimær explants. To explants vil ikke smelte sammen for at danne kimærer, medmindre deres afskårne kanter forsigtigt presses sammen umiddelbart efter, at de er skåret.
Ændringer og fejlfinding
De vigtige trin, der er beskrevet ovenfor, giver muligheder for fejlfinding. Nogle fælles spørgsmål og foreslåede løsninger er beskrevet nedenfor.
Hvis explants ikke strækker sig i nærværelse af Nodal signalering, er der nogle mulige løsninger. A) Injicer embryoner i encellestadiet for at sikre, at RNA spredes jævnt i hele embryoet. (B) Undgå at injicere for meget nodal RNA ved at sikre, at den injicerede volumen er korrekt ved hjælp af et mikrometer til måling af injektions bolus. (C) Undgå at injicere for lidt nodal RNA ved at måle koncentrationen for at sikre, at det ikke er nedbrudt. (D) Hold nogle aldersmatchede intakte søskende for at udlede det tilsvarende stadium af explants. Explants opnå maksimal udvidelse, når intakte søskende nå 2-5 somite fase. Hvis explants indsamles for tidligt, vil den optimale udvidelse ikke blive nået.
Hvis æggeblommer brister efter dechorionation, og embryonerne ikke er levedygtige at skære, skal du fjerne embryonerne fra pronaseopløsningen, når chorions begynder at crinkle og 1-2 embryoner kaste deres chorion. Skyl derefter straks i æggevand.
Hvis explants vises boblende rundt om kanterne, er der nogle løsninger. A) Skær kun explants inden for en bestemt udviklingshorisont. Selv om explants skåret på ethvert tidspunkt fra 128- til 1000-celle stadier kan overleve og udvide i kultur, dem skåret på 256- til 512-celle faser tendens til at være den mest robuste. (B) Sørg for, at explants skæres i 3x Danieaus opløsning for at sikre korrekt heling. (C) Skær explants rent, men forsigtigt. Undgå at strække eller trække cellerne fra hinanden under skæreprocessen.
Hvis de ikke-injicerede kontrol explants strækker sig, explants var tilbøjelige til at skære for tæt på æggeblommen. For explants at være naive, sikre, at nedskæringerne er lavet halvvejs mellem æggeblommen og toppen af blastoderm.
Hvis de kimær explants undlader at smelte, er det sandsynligt, fordi tendensen til explants i 3x Danieau opløsning, når skåret er at runde op og helbrede over cut kant. For at sikre, at de to blastodermer heler til hinanden i stedet for sig selv, skal du trykke dem sammen umiddelbart efter skæring. Brug kraften til at lægge et blidt tryk på de nyligt sluttede blastodermer i agarose godt for at opmuntre dem til at helbrede sammen.
Begrænsninger
Mens disse explants er et værdifuldt redskab til at studere en given morfogens (eller et andet interessemolekyles) rolle i relativ isolation, skal observationer i enhver ex vivo-model fortolkes med omhu. Explants udviser C &E morfogenese, der er meget lig den observerede in vivo20, men de generobrer ikke alle aspekter af gastrulation, for eksempel epiboly bevægelser. De mangler også mange andre regulatoriske faktorer og signalering molekyler, der er til stede i en intakt embryo. Selv om dette er en betydelig eksperimentel fordel ved explants, kan det også føre til konklusioner, der ikke holder in vivo. For eksempel, da explants, der ikke modtager udefrakommende Nodal ligands undlader at udtrykke neuroectoderm markører, kan man konkludere fra explants alene, at Nodal signalering er nødvendig for neuroectoderm specifikation. Men neuroectoderm dannes i intakte embryoner mangler alle Nodal signalering23,24, der viser den vitale rolle andre signalering molekyler i neural specifikation32. Explants kan fortælle os, hvad en morfogen er i stand til i et isoleret miljø. Alligevel bør alle sådanne fund bekræftes i/sammenlignet med intakte embryoner, for at resultaterne kan fortolkes grundigt. Med andre ord kan explants ikke træde i stedet for et embryo under udvikling. I stedet er de et supplerende værktøj til at identificere en morfogens rolle og relation til omgivelserne. Med disse begrænsninger i tankerne er zebrafisk blastoderm explants et værdifuldt værktøj til mange forskningsspørgsmål.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder
Med fornyet interesse for syntetisk embryologi anvendes der regelmæssigt flere ex vivo- og in vitro-tilgange til at modellere aspekter af embryonal udvikling. For eksempel kan 2- og 3-dimensionelle gastruloider bestående af mus eller menneskelige embryonale / inducerede pluripotente stamceller lokkes gennem anvendelse af udefrakommende signalmolekyler for at generobre nogle af de mønstrende og / eller morfogenetiske hændelser af gastrulation, segmentering og neurulation33,34,35,36,37 . Selvom disse metoder er kraftfulde, kræver de besværlige og langvarige dyrkningsmetoder til både kontinuerligt at opretholde pluripotente stamceller og til at dyrke gastruloider, som tager mange dage at nå gastrulationsstadier. I modsætning hertil kræver zebrafisk explants ingen vedligeholdelse af stamcellekulturer, da embryoner simpelthen indsamles efter behov. De er relativt enkle at generere og nå gastrulationsstadier inden for få timer, det samme som zebrafiskembryoner. Dette fremhæver en anden fordel ved zebrafisk explants, deres intakte udviklingsmæssige ur. Fordi udviklingsalderen for embryonale og inducerede pluripotente stamceller kan være varierende og meget omdiskuteret, er embryonale explants måske bedre egnet til at undersøge tidsmæssig regulering af udviklingen. Endelig, mens pescoid zebrafisk explants (som indeholder embryonale margin) ligeledes udvide i kultur12,13, de gør det som reaktion på endogene signalcentre. I stedet gør de tidligere beskrevet forskere i stand til at undersøge molekyler af interesse med relativt lidt interferens fra sådanne embryonale signaler.
Potentielle fremtidige ansøgninger
Her blev explants brugt til at påvise, at Nodal signalering er nødvendig og tilstrækkelig til C &E morfogenese. Alligevel forventes det, at de kan og vil blive brugt til at skelne mange forskellige molekylers rolle i mange andre udviklingsprocesser, for eksempel regulering af genekspression, signaleringsgradienter og yderligere morfogenetiske programmer. Derudover, fordi disse explants er levedygtige indtil mindst 24 hkf19, kan det forventes, at deres nytte vil strække sig ud over gastrulation i processer som segmentering og organogenese, enhver proces, hvor forskerne ønsker en udviklingsmæssig blank tavle.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NICHD R00HD091386 til MLKW og af NIEHS T32ES027801 til AAE.
1 mm glass beads | Millipore-Sigma | Z250473 | |
4% Paraformaldehyde | VWR | J19943-K2 | |
6-well plates | Fisher | FB012927 | |
Agarose | Thermo-Fisher | 16500500 | |
Ca(NO3)2 .4H2O | Thermo-Fisher | 12364-36 | |
DMEM/F12 media | Gibco | 11330032 | |
Dumont #5 watchmakers forceps | World Precision Instruments | 500341 | |
Embryo injection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
Glass crystalizing dishes | Fisher | 08-741A | |
Glass Petri dishes | Fisher | 08-748A | |
HEPES | VWR | JT4018-1 | |
Instant Ocean sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
KCl | VWR | BDH9258-500G | |
Low temperature incubator | Fisher | 15-015-2632 | |
MgSO4.7H2O | VWR | 97062-134 | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
Micrometer | SPI supplies | 02265-AB | |
Mineral oil | VWR | MK635704 | |
NaCl | VWR | BDH9286-500G | |
Newborn Calf Serum | Invitrogen | 26010-066 | |
Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-30 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo-Fisher | 15140122 | |
Pico-pump pneumatic injector | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
Pipet pump | Fisher | 13 683C | |
Plastic Petri dishes 100 mm | Fisher | FB0875712 | |
Plastic Petri dishes 60 mm | Fisher | FB0875713A | |
Plastic wash bottles | Fisher | 03-409-10E | |
Pronase | Millipore-Sigma | 10165921001 | |
Tween-20 | VWR | 200002-836 |