本协议提供了来自主动收缩的心脏气管 前体内的肉瘤、钙和宏观几何数据的集合。这些同时测量是通过整合三种成像方式实现的。
在心脏肌肉中,细胞内 Ca2+ 瞬态激活收缩肌肌,导致收缩、宏观缩短和几何变形。我们对这些事件之间的内部关系的理解是有限的,因为我们既不能”看到”肌肉内部,也不能精确跟踪激发收缩动力学的时空性质。为了解决这些问题,我们构建了一个结合了一套成像模式的设备。具体来说,它集成了一个明亮的场显微镜来测量肉瘤长度和组织应变的局部变化,一个荧光显微镜来可视化Ca2+ 瞬态,以及一个光学相干断层仪来捕捉组织在整个心脏周期过程中的几何变化。我们在此处展示成像基础设施和相关数据收集框架。数据是从称为特拉贝库莱卡内亚的孤立棒状组织结构中收集的。在我们的仪器中,一对位置控制的铂金钩可固定 前体 肌肉样本的每一端,同时不断与富含营养的盐水溶液相叠入。钩子在独立控制下,允许实时控制肌肉长度和力量。纵向翻译可对样品进行逐件扫描,克服与显微镜成像窗口相对大小(540 μm 乘 540 μm)和典型气管长度(> 2000 μm)相关的限制。肌肉室两端的白金电极以用户定义的速度刺激气管。我们利用刺激信号作为触发器,同步来自每个成像窗口的数据,以重建在稳定状态条件下的整个样本抽搐。将图像处理技术应用于这些明亮的场成像数据,可提供组织位移和肉瘤长度图。这种数据收集,如果纳入实验建模管道,将更深入地了解肌肉收缩同质性和生理学和病理生理学中的异质性。
分离心脏肌肉组织制剂的超级输液是研究心脏离子活化和力学1的标准和广泛使用的方案。特别是,从心室壁中分离出类似杆状结构的气管,能够评估各种现象,包括收缩2的长度依赖激活、收缩3、4和心脏组织扩张粘度5的拉伸依赖反应。Ter Keurs,这种超融合分离性气管技术的发起人,最初使用荧光成像相结合的Ca2+测量和激光衍射来确定肉瘤长度2,5。自这些早期研究以来,使用基于2D快速 Fourier 变换 (FFT) 的技术 6 在亮场显微镜图像上提取具有更大空间分辨率的肉瘤长度信息变得越来越普遍。这两个成像系统允许部分评估Ca2+释放和肉瘤长度依赖力生产之间的基本关系。
心脏肌肉被收缩,可见的带状物与由厚和厚的细丝组成的一系列潜在的收缩单元相关联。构成肉瘤的这些组成丝的相互作用是力生成的基础,其开始如下:去极化电信号或作用电位,导致细胞膜中依赖电压的 L 型 Ca2+ 通道打开;随后的细胞流入Ca2+ 诱导Ca2+ 从肉瘤再细胞(SR),细胞内Ca2+ 存储释放,这个过程称为Ca2+诱导Ca2+ 释放7;细胞内Ca2+ 浓度从纳米摩尔突然增加到微摩尔范围,使力生产发生;Ca2+ 泵不断挤出细胞 溶胶,再挤出细胞溶胶回 SR 和细胞外隔间;当细胞内Ca2+ 浓度回到纳米摩尔范围时,强制生产停止,肌肉放松。在力生产过程中,成分之一的厚细细丝相互滑动。肉瘤长度决定了重叠的相对程度,因此,从宏观上决定肌肉的力生成潜力。
本文将这些荧光亮场成像技术扩展到光学相干断层扫描 (OCT)。OCT利用干扰的物理原理,能够获得组织的几何变形,以理解肌肉收缩异质性8。我们的设备 (图 1)使用光谱域 OCT (SD-OCT) 系统。在 SD-OCT 中,光束分离器将光从宽带短一致性长度的超发光二极管中分离成参考和测量臂。参考臂包含固定镜,测量臂包含二维电压计来引导光线。收集从样品中反散射的光线并干扰参考臂中的反射光,形成干扰模式。深度信息以光谱边缘的频率进行编码。要提取信息,信号通过光谱仪传递,结果应用反向 FFT。相应的 1D 信号表示不同深度的结构,对应折射指数9 (A 扫描) 的变化。通过在单轴中引导激光,可以构建感兴趣的示例(B 扫描)的横截面,并且,通过在剩余轴的步进模式中重复该过程,可以生成三维图像(C 扫描)。通过扩展,人们可以在一个切片上收集一系列B扫描,以便根据外部触发器重复时间变化的主题,并重复生成三维扫描,代表一个时间变化的平面图像10。
在整合三个成像系统时,我们考虑了以下两个原则。首先,成像传感器不应从替代成像方式检测光线:其次,物理设计应包含至少三个同时成像平面的自由空间。为了满足第一个要求,亮场显微镜使用 660 nm 波长 LED 以倒置配置照亮样品。荧光显微镜采用表观配置,用于激发和收集发射的光。激发光的波长在 340 nm 到 380 nm 之间,光电管 (PMT) 测量 510 nm 的波长发射的光。一对二色反射镜使这两个光学路径共享相同的物理足迹,而不会干扰相反的测量(图2)。最后,OCT 使用中央波长为 840 nm 的宽带(100 nm 光谱宽度)光,与其他两种模式不同。由于 OCT 所用光的低一致性,来自亮场荧光源的任何散射光都无助于编码深度信息的干扰模式。对于第二个要求,毛细管的外壳设计具有可访问到样品前部、劣质和高级平面的光学通路。在实验中,两个铂金钩在毛细管内持有一个带氧的克雷布斯-亨塞莱特(KH)溶液的管子。OCT 的镀锌仪头正交定向到亮场荧光成像通路,以利用第三个正交光学平面(图 3)。
本文概述了构建能够同时成像钙、肉瘤长度和肌肉几何形状的设备的设计考虑。为了证明这些测量能力,我们描述了隔离心室气管的过程,准备必要的缓冲解决方案,以及处理和荧光负荷 前气管 的关键步骤。最后,本文概述了将数据集转换为更有用的可视化所需的流程。
在这项研究中,我们提出了一个配置,使三个光学系统的组装结合了亮场,荧光和OCT成像,以收集数据从积极收缩的前体内心脏气管(图1和图2)。这种精心策划的集成是可能的,因为测量室(图3)的设计,使OCT的正交排列到明亮的场荧光轴。肌肉安装系统在心脏肌肉激发收缩动力学特征的关键指标同时量化的成功中起着同样重要的作用。它的新颖性在于使肌肉扫描程序没有明显的干扰肌肉的机械性能(图6)。该系统结合成像配置和电动钩系统进行力测量,可评估Ca2+瞬态、位移和肉瘤长度的区域异质性,以及在抽搐过程中收缩的气管的宏观几何信息(图7和图8)。
鉴于心脏研究实验室中明亮的场-表光成像系统无处不在,这些结果的复制可以通过一些次要的硬件考虑来实现。在这里,我们介绍了图像处理工具包,用于结合亮场-表光和OCT,这在分析潜在的收缩异质性方面至关重要。OCT 的集成需要畅通无阻的光学路径,而门控成像需要刺激和 OCT 和亮场成像摄像机之间的外部触发线,以及能够将样品移动到整个测量室的肌肉安装钩。所需的后处理软件和方法可免费获得。特别是,使用的细分软件WEKA14是开源的。材料点8、肉瘤长度、门控体积成像10和网状生成代码的无标记跟踪技术同样可访问,并可应相应作者的要求提供。
肌肉生存能力、Fura-2 的最佳负载和图像对焦是构成成功实验基础的三大支柱。使用含有BDM的解剖溶液来防止收缩、注射器中肌肉的输送、溶液的连续氧合,以及在实验当天准备新的实验解决方案,所有这些都有助于提高肌肉的生存率。在用 Fura-2AM 装载特拉贝库拉之前,必须收集对每种情况的自动荧光,因为这会对测量的 Ca2+ 瞬态15产生重大影响。Fura-2AM 装载解决方案的氧合由于需要加入表面活性剂普鲁尼奇-F127 以帮助染料装载而变得复杂。为了对抗这种表面活性剂引起的过度气泡形成,装载溶液中的一小滴防泡沫使用户能够提高氧化率,从而提高 trabecula 在整个装载过程中保持功能活力的机会。最后,成像焦点必须沿肌肉长度均匀,以最大限度地提高亮场和荧光信息的信号与噪声比。
此处提出的方法有两个限制需要考虑。首先是荧光显微镜的空间分辨率。虽然 OCT 的空间分辨率和亮场成像率很高,但荧光显微镜的分辨率仅限于从 540 μm 乘 540 μm 成像窗口内捕获的体积中捕获的荧光的完整性。使用高增益耦合装置摄像头(而不是 PMT)来捕获荧光信号,以牺牲信号与噪声比16为代价,从而增加荧光显微镜的空间分辨率。第二是气管的直径,可以从可测量的肉瘤长度和几何深度来研究。用于计算肉瘤长度的窗口式 FFT 方法利用了改进空间分辨率的好处,但与降低稳健性相关(图 8D)。在需要研究浑浊或大直径气管的情况下,由于与较大组织样本中的肉瘤带相关的对比度降低,FFT 的可溶性将大大降低。同样,在 OCT 中,来自大于 300 μm 的成像深度的背反射将太弱,无法在分割阶段解决。因此,我们的技术仅限于直径小于 300 μm 的气管。然而,不建议研究大直径样品,因为在高刺激率17期间,肌肉核心的扩散氧合可能有问题。
我们的方法使离子机械功能与健康和患病肌肉中的肌肉几何学相关,为理解心脏肌肉生理学、病理生理学和药理学提供了强有力的方法。此处概述的图像处理管道提取的数据对于更深入地了解收缩异质性至关重要。充分实现如此丰富的数据集潜力的一个途径是构建集成和解释这些数据的数学模型,并做出可使用我们的设备进行实验性测试的预测。
The authors have nothing to disclose.
这项研究由奥克兰大学(授予JD和MC)、查尔斯·赫库斯爵士健康研究奖学金(20/011和21/116)的新西兰健康研究理事会(授予J-CH至KT) 的博士奖学金资助。 分别由国家心脏基金会(授予AA)、新西兰皇家学会颁发的马斯登快速启动助学金(UOA1504和UOA1703)颁发的博士学位(授予J-CH和KT, 分别)和来自新西兰皇家学会的詹姆斯·库克研究奖学金(授予美国之友协会)。该仪器的最初开发由新西兰皇家学会(授予美国之和军用)的马斯登赠款(11-UOA-199)资助。
2,3-Butanedione monoxime | Acros Organics | 150375000 | |
20× microscope lens | Nikon | CFI Super Fluor 20× | NA 0.75 |
2D Galvanometer | Thorlabs | GVSM002/M | |
50-50 beam splitter | Thorlabs | FC850-40-50-APC | |
90-10 beam-splitter | Thorlabs | TW850R2A2 | |
Analogue input module | National Instruments | NI-9205 | Records the PMT signal at 200 kHz |
Brightfield imaging light source | CoolLED | PE-2 | 660 nm LAM |
Broadband light source | Superlum | Broadlighter-840 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
Cameralink card | National Instruments | NI-1429 | Brightfield imaging frame grabber |
Carbogen 5 | BOC | Gas code: 181 | |
Condensor lens | Nikon | LWD 0.52 | |
D(+)-Glucose | Merck | 108337 | |
DAQ | National Instruments | NI-6259 | Triggers the galvanometer movement |
Dichroic mirror 1 | Semrock | FF409-Di03 | |
Dichroic mirror 2 | Semrock | FF552-Di02 | |
Diffraction grating | Wasatch Photonics | 1200 lines/mm @840 nm | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
Direct-Q 3 UV System | Merck Millipore | ZRQSVR3WW | Distilled water machine |
Dry bath | Corning | 6875-SB | LSE digital dry bath |
FIJI | ImageJ | Open-source image processing software | |
Fura-2AM pentapotassium salt | Thermofisher | F14186 | |
Hardware FPGA card | National Instruments | NI-7813R | Also controls the triggering of the brightfield capture |
Heparin | Pfizer | 61024 | |
HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
Inverted microscope | Nikon | TI-DH illumination pillar | |
Isofluorane | MedSource | VAPDRUGISO250 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Line-scan camera | Basler | spL2048-70km | Spectrometer camera |
Magnetic stirrer | IKA | 3810000 | RCT basic |
Matlab | Mathworks | Data processing code | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
NaH2PO4.2H2O | Sigma-Aldrich | 71505 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
OCT FPGA card | National Instruments | NI-1483R | |
Oxygen tank | BOC | Gas code: 100D | |
pH meter | Mettler Toledo | MP220 | |
Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422-20 | |
Powerload | Thermofisher | P10020 | |
Superluminescent diode | Broadlighter | D-840 | |
Transimpedance amplifier | Custom | ||
Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
Wistar rat | Vernon Jansen Unit | 8 – 10 weeks | |
Xenon arc lamp | Sutter Instrument | DG-4 | Lambda DG-4 |