Denne protokol præsenterer en samling af sarkomere, calcium og makroskopiske geometriske data fra en aktivt ordregivende hjerte trabecula ex vivo. Disse samtidige målinger muliggøres ved integrering af tre billedbehandlingsmetoder.
I hjertemusklen aktiverer intracellulære Ca2+ transienter kontraktile myofilaments, hvilket forårsager sammentrækning, makroskopisk afkortning og geometrisk deformation. Vores forståelse af de interne relationer mellem disse begivenheder har været begrænset, fordi vi hverken kan ‘se’ inde i musklen eller præcist spore spatio-temporal karakter excitation-sammentrækning dynamik. For at løse disse problemer har vi konstrueret en enhed, der kombinerer en række billedbehandlingsmetoder. Specifikt, det integrerer et lysfelt mikroskop til at måle lokale ændringer af sarkomere længde og væv stamme, en fluorescens mikroskop til at visualisere Ca2 + forbigående, og en optisk sammenhæng tomograph at fange vævets geometriske ændringer i hele tiden løbet af en hjertecyklus. Vi præsenterer her billedbehandlingsinfrastrukturen og de tilhørende dataindsamlingsrammer. Data indsamles fra isolerede stanglignende vævsstrukturer kendt som trabeculae carneae. I vores instrument holder et par positionsstyrede platinkroge hver ende af en ex vivo muskelprøve, mens den kontinuerligt superfunderes med næringsrig saltvandsopløsning. Krogene er under uafhængig kontrol, hvilket tillader realtidskontrol af muskellængde og kraft. Oversættelse i længderetningen gør det muligt at scanne prøven i det samme og overvinde de begrænsninger, der er forbundet med mikroskopets billedvindues relative størrelse (540 μm med 540 μm) og længden af en typisk trabecula (>2000 μm). Platinelektroder i hver ende af muskelkammeret stimulerer trabecula ved en brugerdefineret hastighed. Vi udnytter stimuleringssignalet som en udløser til synkronisering af data fra hvert billedvindue til at rekonstruere hele prøvetrækning under konstante tilstandsforhold. Anvendelse af billedbehandlingsteknikker på disse brightfield imaging data giver væv forskydning og sarkomere længde kort. En sådan indsamling af data vil, når den indarbejdes i en eksperimentmodelleringspipeline, give en dybere forståelse af muskelkontraktil homogenitet og heterogenitet i fysiologi og patofysiologi.
Superfusion af isolerede hjertemuskelvævspræparater er en standard og udbredt protokol til undersøgelse af hjerteionisk aktivering ogmekanik 1. Især har isoleringen af trabeculae, stanglignende strukturer fra ventrikulære vægge gjort det muligt at vurdere fænomener, herunder den længdeafhængige aktivering af sammentrækning2, strækafhængig reaktion af sammentrækning3,4og diastolisk viskoelasticitet5 af hjertevæv. Ter Keurs, initiativtageren til denne teknik til superfusing isoleret trabeculae, oprindeligt brugt en kombination af fluorescens imaging for Ca2 + målinger og laser diffraktion til bestemmelse af sarkom længder2,5. Siden disse tidlige undersøgelser er det blevet mere og mere almindeligt at udtrække sarkomere længdeoplysninger med en større rumlig opløsning ved hjælp af 2D hurtige Fourier transform (FFT)-baserede teknikker6 på brightfield mikroskopibilleder. De to billeddannelsessystemer gør det muligt delvis at vurdere det underliggende forhold mellem Ca2+-udløsning og sarkomkom-afhængig kraftproduktion.
Hjertemusklen er striated, med den synlige banding forbundet med en underliggende serie af kontraktile enheder bestående af tykke og tykke filamenter. Samspillet mellem disse bestanddele filamenter, der udgør sarkomenter ligger til grund kraft generation, som begynder som følger: en depolarizing elektrisk signal, eller virkning potentiale, forårsager spænding-afhængige L-type Ca2 + kanaler i cellemembranen til at åbne; den efterfølgende cellulære tilstrømning af Ca2+ fremkalder frigivelsen af Ca2+ fra sarcoplasmic reticulum (SR), en intracellulær Ca2+ butik, i en proces, der kaldes Ca2+-induceret Ca2+ release7; denne pludselige stigning i intracellulær Ca2+-koncentration fra nanomolar til mikromolar-sortiment gør det muligt at producere kraft Ca2+ pumper ekstruderer kontinuerligt Ca2+ ud af cytosolen tilbage i SR og ekstracellulært rum; når den intracellulære Ca2 + koncentration vender tilbage til nanomolar rækkevidde, kraftproduktion ophører, og musklen slapper af. Under kraftproduktion glider komponenten tykke og tynde filamenter over hinanden. Sarkomlængden dikterer det relative omfang af overlapning og dermed potentialet for kraftproduktion af musklen makroskopisk.
I dette papir udvider vi disse fluorescens-brightfield imaging teknikker til at omfatte optisk sammenhæng tomografi (OCT). OCT udnytter det fysiske princip om interferens og er i stand til at samle den geometriske deformation af væv for at forstå muskelkontraktil heterogenitet8. Vores enhed (Figur 1) bruger et Spektraldomæne OCT (SD-OCT) system. I SD-OCT opdeler en stråledeler lyset fra et kortbåndslængde superluminescerende diode i reference- og målearme. Referencearmen indeholder et fast spejl, og målearmen indeholder et 2D-galvanometer til at styre lyset. Lys, der sprøjtes ud af prøven, indsamles og forstyrrer det reflekterede lys i referencearmen for at danne et interferensmønster. Dybdeinformationen er kodet i frekvensen af spektral frynserne. For at udtrække oplysningerne sendes signalet gennem et spektrometer, og der påføres en omvendt FFT på resultatet. Det tilsvarende 1D-signal repræsenterer strukturerne på forskellige dybder, svarende til ændringer i brydningsindeks9 (A-scanning). Ved at styre laseren i en enkelt akse, kan man konstruere et tværsnit af stikprøven af interesse (B-scanning), og på samme måde, ved at gentage processen i et trin-klog mønster i den resterende akse, en tre-dimensionel billede kan genereres (C-scanning). I forlængelse heraf kan man indsamle en række B-scanninger på et enkelt udsnit for en gentaget tids-varierende emne baseret på en ekstern udløser og gentag for at generere en tre-dimensionel scanning, der repræsenterer en tids-varierende planar billede10.
Ved integrationen af de tre billeddannelsessystemer har vi overvejet følgende to principper. For det første bør billedsensorer ikke registrere lys fra en alternativ billedbehandlingsmodalitet, og for det andet bør det fysiske design indeholde ledig plads til mindst tre samtidige billedplaner. For at imødekomme det første krav bruger brightfield-mikroskopet en 660 nm bølgelængde-LED til at belyse prøven i en omvendt konfiguration. Fluorescensmikroskopet er i en epifluorescenskonfiguration, hvor den samme objektive linse anvendes til både excitation og indsamling af det udsendte lys. Excitationslyset har en bølgelængde på mellem 340 nm og 380 nm, og et fotomultiplierrør (PMT) måler det udsendte lys ved en bølgelængde på 510 nm. Et par dichroic spejle gør det muligt for disse to optiske stier til at dele den samme fysiske fodaftryk uden at forstyrre den modsatte måling (Figur 2). Endelig anvender OLT bredbåndslys (100 nm spektral bredde) med en central bølgelængde på 840 nm, der adskiller sig fra de to andre modaliteter. På grund af lysets lave sammenhæng vil alt spredt lys fra lysfelt-fluorescenskilderne ikke bidrage til det interferensmønster, der koder dybdeinformation. For det andet krav har boligdesignet til kapillærrøret tilgængelige optiske veje til prøvens forreste, ringere og overlegne planer. Under forsøg holder to platinkroge en trabecula i et kapillærrør perfunderet med iltet Krebs-Henseleit (KH) opløsning. OLT’s galvanometerhoved er ortogonalt orienteret mod den lysefield-fluorescensbilleddannelsesvej for at drage fordel af det tredje ortogonale optiske plan (figur 3).
Dette papir skitserer design overvejelser for at opbygge en enhed i stand til samtidig billeddannelse calcium, sarkomere længde, og muskel geometri. For at demonstrere disse måleevner beskriver vi processen med at isolere en ventrikulær trabecula, forberedelsen af de nødvendige bufferopløsninger sammen med de kritiske trin, der er involveret i håndtering og fluorescensbelastning af en ex vivo trabecula. Endelig skitserer dette papir de processer, der kræves for at oversætte datasættet til mere nyttige visualiseringer.
I denne undersøgelse præsenterer vi en konfiguration, der gør det muligt at samle tre optiske systemer, der kombinerer lysfelt, fluorescens og OLT-billeddannelse, for at indsamle data fra en aktivt kontraherende ex vivo-hjerte trabecula (figur 1 og figur 2). En sådan orkestreret integration er mulig på grund af målekammerets udformning (figur 3) for at gøre det muligt for OLT at arrangere det ortogonale arrangement med lysfelt-fluorescensaksen. Muskelmonteringssystemet spiller en lige så vigtig rolle i succesen med samtidige kvantificeringer af nøgleindekser til karakterisering af hjertemuskeludringssammentrækningsdynamik. Dens nyhed ligger i at muliggøre muskelscanning procedurer uden tilsyneladende forstyrrelse af den mekaniske ydeevne af musklen (Figur 6). Med den kombinerede billeddannelse konfiguration og motoriseret-hook system til kraft måling, kan dette system vurdere regionale heterogenitet i Ca2 + forbigående, forskydning, og sarkomere længde, sammen med makroskopisk geometrisk information om en ordregivende trabecula hele tiden løbet af træk(Figur 7 og Figur 8).
I betragtning af allestedsnærværende lysfelt-epifluorescens imaging systemer inden for hjerteforskning laboratorier, reproduktion af disse resultater kan opnås med nogle mindre hardware overvejelser. Her præsenterer vi billedbehandlingsværktøjssættet til at kombinere brightfield-epifluorescens og OCT, hvilket er afgørende for at analysere den underliggende kontraktil heterogenitet. Integrationen af OLT kræver en uhindret optisk sti, mens den indhegnede billeddannelse kræver en ekstern udløserlinje mellem stimulus og både OCT- og brightfield-billedkameraet og muskelmonteringskroge, der er i stand til at flytte prøven gennem målekammeret. Den nødvendige efterbehandling software og metoder er frit tilgængelige. Især segmentering software, der anvendes, WEKA14, er open source. Teknikken med markørløs sporing af materialepunkter8, sarkomlængde, indhegnet volumetrisk billeddannelse10og mesh-genereringskoder er ligeledes tilgængelige og kan stilles til rådighed efter anmodning fra den tilsvarende forfatter.
Muskel levedygtighed, optimal belastning af Fura-2, og billedfokus er de tre søjler, der danner grundlaget for et vellykket eksperiment. Ved hjælp af en dissektionsopløsning, der indeholder BDM for at forhindre kontraktur, transport af musklen i en sprøjte, kontinuerlig iltning af opløsningen og forberedelse af nye eksperimentelle løsninger på dagen for et eksperiment, bidrager alle til en høj muskelkraft. Før trabecula lastes med Fura-02:00, skal autofluorescens indsamles for hver betingelse man er interesseret i at studere, da det kan have en betydelig effekt på den målte Ca2 + forbigående15. Iltning af Fura-2AM loading løsning kompliceres af den nødvendige inddragelse af overfladeaktive pluronic-F127 at støtte farvestof lastning. For at bekæmpe den resulterende overskydende bobledannelse forårsaget af dette overfladeaktive middel giver en lille dråbe antiskum i lasteopløsningen brugeren mulighed for at øge iltningshastigheden og derved forbedre chancen for, at trabecula opretholder funktionel levedygtighed under hele belastningsprocessen. Endelig skal billeddiagnostik fokus være ensartet langs muskellængde for at maksimere signalet til støj-forholdet af brightfield og fluorescens oplysninger.
Der er to begrænsninger at overveje med de metoder, der præsenteres her. For det første er den rumlige opløsning af fluorescensmikroskopet. Mens OLT’s rumlige opløsninger og lysfeltsbilleddannelse er høje, er opløsningen af fluorescensmikroskopet begrænset til en integreret del af fluorescensen fra det volumen, der er fanget inden for et 540 μm med 540 μm billedvindue. Der er mulighed for at øge den rumlige opløsning af fluorescensmikroskopet ved at bruge et høj-gain opladningskoblet enhedskamera i stedet for en PMT til at opfange fluorescenssignalet på bekostning af signalet til støjforhold16. For det andet er diameteren af trabecula, der kan studeres i form af målbare sarkom længde og geometrisk dybde. Den vinduesbaserede FFT-tilgang til beregning af sarkomlængde udnytter fordelen ved forbedret rumlig opløsning, men er forbundet med reduceret robusthed (figur 8D). I tilfælde, hvor turbid eller stor diameter trabeculae skal undersøges, vil fft’ens opløsning blive stærkt reduceret på grund af den reducerede kontrast, der er forbundet med sarkomerisk stribe i større vævsprøver. På samme måde vil rygrefleksionerne fra en billeddybde på over 300 μm inden for OLT være for svage til at blive løst i segmenteringsfasen. Derfor er vores teknik begrænset til trabeculae med en diameter på mindre end 300 μm. Det anbefales dog ikke at studere prøver med stor diameter, da der kan være problemer med diffust iltning af muskelkernen under høje stimuleringshastigheder17.
Vores metode gør det muligt at vurdere ionisk mekanisk funktion i forbindelse med muskelgeometri i sunde og syge muskler, hvilket giver en kraftfuld tilgang til forståelse af hjertemuskelfysiologi, patofysiologi og farmakologi. Den billedbehandlingspipeline, der er skitseret her, udtrækker data, der vil være afgørende for at opnå en dybere forståelse af kontraktil heterogenitet. En vej til fuldt ud at realisere potentialet i et så rigt datasæt er i konstruktionen af matematiske modeller, der integrerer og fortolker disse data, og at lave forudsigelser, der kan testes eksperimentelt ved hjælp af vores enhed.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev finansieret af Ph.d.-stipendier fra University of Auckland (tildelt JD og MC), Sir Charles Hercus Health Research Fellowships (20/011 og 21/116) fra Health Research Council of New Zealand (tildelt J-CH til KT, henholdsvis), et ph.d.-stipendium tildelt af National Heart Foundation (tildelt AA), Marsden Fast-Start tilskud (UOA1504 og UOA1703) fra Royal Society of New Zealand (tildelt J-CH og KT, henholdsvis), og en James Cook Research Fellowship fra Royal Society of New Zealand (tildelt AT). Den oprindelige udvikling af dette instrument blev finansieret af et Marsden-tilskud (11-UOA-199) fra Royal Society of New Zealand (tildelt AT og PN).
2,3-Butanedione monoxime | Acros Organics | 150375000 | |
20× microscope lens | Nikon | CFI Super Fluor 20× | NA 0.75 |
2D Galvanometer | Thorlabs | GVSM002/M | |
50-50 beam splitter | Thorlabs | FC850-40-50-APC | |
90-10 beam-splitter | Thorlabs | TW850R2A2 | |
Analogue input module | National Instruments | NI-9205 | Records the PMT signal at 200 kHz |
Brightfield imaging light source | CoolLED | PE-2 | 660 nm LAM |
Broadband light source | Superlum | Broadlighter-840 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
Cameralink card | National Instruments | NI-1429 | Brightfield imaging frame grabber |
Carbogen 5 | BOC | Gas code: 181 | |
Condensor lens | Nikon | LWD 0.52 | |
D(+)-Glucose | Merck | 108337 | |
DAQ | National Instruments | NI-6259 | Triggers the galvanometer movement |
Dichroic mirror 1 | Semrock | FF409-Di03 | |
Dichroic mirror 2 | Semrock | FF552-Di02 | |
Diffraction grating | Wasatch Photonics | 1200 lines/mm @840 nm | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
Direct-Q 3 UV System | Merck Millipore | ZRQSVR3WW | Distilled water machine |
Dry bath | Corning | 6875-SB | LSE digital dry bath |
FIJI | ImageJ | Open-source image processing software | |
Fura-2AM pentapotassium salt | Thermofisher | F14186 | |
Hardware FPGA card | National Instruments | NI-7813R | Also controls the triggering of the brightfield capture |
Heparin | Pfizer | 61024 | |
HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
Inverted microscope | Nikon | TI-DH illumination pillar | |
Isofluorane | MedSource | VAPDRUGISO250 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Line-scan camera | Basler | spL2048-70km | Spectrometer camera |
Magnetic stirrer | IKA | 3810000 | RCT basic |
Matlab | Mathworks | Data processing code | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
NaH2PO4.2H2O | Sigma-Aldrich | 71505 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
OCT FPGA card | National Instruments | NI-1483R | |
Oxygen tank | BOC | Gas code: 100D | |
pH meter | Mettler Toledo | MP220 | |
Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422-20 | |
Powerload | Thermofisher | P10020 | |
Superluminescent diode | Broadlighter | D-840 | |
Transimpedance amplifier | Custom | ||
Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
Wistar rat | Vernon Jansen Unit | 8 – 10 weeks | |
Xenon arc lamp | Sutter Instrument | DG-4 | Lambda DG-4 |