Denne protokollen presenterer en samling sarkomer, kalsium og makroskopiske geometriske data fra en aktivt kontraherende hjertetrabecula ex vivo. Disse samtidige målingene er muliggjort ved integrering av tre bildemodaliteter.
I hjertemuskelen aktiverer intracellulære Ca2+ transienter kontraktile myofilaments, forårsaker sammentrekning, makroskopisk forkortelse og geometrisk deformasjon. Vår forståelse av de interne relasjonene mellom disse hendelsene har vært begrenset fordi vi verken kan “se” inne i muskelen eller nøyaktig spore den romlige-temporale naturen til eksitasjons-sammentrekningsdynamikk. For å løse disse problemene har vi konstruert en enhet som kombinerer en pakke med bildemodaliteter. Spesielt integrerer den et brightfield-mikroskop for å måle lokale endringer av sarcomere lengde og vevsstamme, et fluorescensmikroskop for å visualisere Ca2 + forbigående, og en optisk koherenstomografi for å fange vevets geometriske endringer gjennom hele hjertesyklusen. Her presenterer vi bildeinfrastrukturen og tilhørende rammeverk for datainnsamling. Data samles inn fra isolerte stanglignende vevsstrukturer kjent som trabekulær carneae. I vårt instrument holder et par posisjonskontrollerte platinakroker hver ende av en ex vivo muskelprøve mens den kontinuerlig superfunderes med næringsrik saltløsning. Krokene er under uavhengig kontroll, noe som tillater sanntidskontroll av muskellengde og kraft. På langsgående oversettelse muliggjør den stykkevise skanningen av prøven, overvinne begrensninger knyttet til den relative størrelsen på mikroskopets bildevindu (540 μm med 540 μm) og lengden på en typisk trabecula (>2000 μm). Platinaelektroder i hver ende av muskelkammeret stimulerer trabecula i en brukerdefinert hastighet. Vi utnytter stimuleringssignalet som en utløser for synkronisering av dataene fra hvert bildevindu for å rekonstruere hele prøverykningen under steady-state-forhold. Bruk av bildebehandlingsteknikker på disse brightfield-bildedataene gir vevsforskyvning og sarcomere lengdekart. En slik innsamling av data, når de innlemmes i en eksperimentmodelleringsrørledning, vil gi en dypere forståelse av muskelkontraktil homogenitet og heterogenitet i fysiologi og patofysiologi.
Superfusjon av isolerte hjertemuskelvevspreparater er en standard og mye brukt protokoll for å studere hjerteionisk aktivering ogmekanikk 1. Spesielt har isolasjonen av trabekulære, stanglignende strukturer fra ventrikkelveggene aktivert vurdering av fenomener, inkludert lengdeavhengig aktivering av sammentrekning2, strekkavhengig respons av sammentrekning3,4og diastolisk viskoelastisitet5 av hjertevev. Ter Keurs, initiativtaker til denne teknikken for superfusing isolert trabeculae, først brukt en kombinasjon av fluorescens avbildning for Ca2 + målinger og laser diffraksjon for å bestemme sarcomere lengder2,5. Siden disse tidlige studiene har det blitt stadig vanligere å trekke ut sarkomerlengdeinformasjon med større romlig oppløsning ved hjelp av 2D-raske Fouriertransformasjonsteknikker (FFT)6 på brightfield-mikroskopibilder. De to bildesystemene tillater en delvis vurdering av det underliggende forholdet mellom Ca2+ release og sarcomere lengdeavhengig kraftproduksjon.
Hjertemuskelen er striated, med synlig banding forbundet med en underliggende serie av kontraktile enheter som består av tykke og tykke filamenter. Samspillet mellom disse bestanddelene som utgjør sarcomeres ligger til grunn for kraftgenerering, som starter som følger: et depolariserende elektrisk signal, eller handlingspotensial, fører til at spenningsavhengige L-type Ca2 + kanaler i cellemembranen åpnes; den påfølgende cellulære tilstrømningen av Ca2+ induserer utgivelsen av Ca2+ fra sarkoplasmic retikulum (SR), en intracellulær Ca2 + butikk, i en prosess kjent som Ca2 +-indusert Ca2 + utgivelse7; denne plutselige økningen i intracellulær Ca2 + konsentrasjon fra nanomolar til mikromolar rekkevidde gjør det mulig å produsere kraft; Ca2+ pumper ekstruderer kontinuerlig Ca2+ ut av cytosolen tilbake i SR og ekstracellulært rom; når den intracellulære Ca2 + konsentrasjonen vender tilbake til nanomolarområdet, opphører kraftproduksjonen, og muskelen slapper av. Under kraftproduksjon glir de bestanddelene tykke og tynne filamenter over hverandre. Sarcomere-lengden dikterer den relative omfanget av overlapping og derfor potensialet for kraftproduksjon av muskelen makroskopisk.
I dette dokumentet utvider vi disse fluorescens-brightfield avbildningsteknikkene for å inkludere optisk koherenstomografi (OCT). OCT utnytter det fysiske prinsippet om forstyrrelser og er i stand til å skaffe geometrisk deformasjon av vev for å forstå muskelkontrahert heterogeneitet8. Enheten vår (figur 1) bruker et spektraldomene OCT (SD-OCT) system. I SD-OCT deler en strålesplitter lyset fra en kort koherenslengde superluminescent diode i referanse- og målearmer. Referansearmen inneholder et fast speil, og målearmen inneholder et 2D-galvanisometer for å styre lyset. Lys som er tilbakevist fra prøven samles inn og forstyrrer det reflekterte lyset i referansearmen for å danne et interferensmønster. Dybdeinformasjonen er kodet i hyppigheten av spektralkanten. For å trekke ut informasjonen, sendes signalet gjennom et spektrometer og en omvendt FFT påføres resultatet. Det tilsvarende 1D-signalet representerer strukturene på forskjellige dybder, tilsvarende endringer i brytningsindeks9 (A-skanning). Ved å styre laseren i en enkelt akse, kan man konstruere et tverrsnitt av prøven av interesse (B-skanning) og på samme måte ved å gjenta prosessen i et trinnvis mønster i den gjenværende aksen, kan et tredimensjonalt bilde genereres (C-skanning). I forlengelsen kan man samle en serie B-skanninger på ett enkelt stykke for et gjentatt tidsvarierende motiv basert på en ekstern utløser og gjenta for å generere en tredimensjonal skanning, som representerer et tidsvarierende planbilde10.
Ved integrering av de tre bildesystemene har vi vurdert følgende to prinsipper. For det første bør bildesensorer ikke oppdage lys fra en alternativ bildemodalitet, og for det andre bør den fysiske designen inneholde ledig plass til minst tre samtidige bildeplan. For å løse det første kravet bruker brightfield-mikroskopet en 660 nm bølgelengde-LED for å belyse prøven i en invertert konfigurasjon. Fluorescensmikroskopet er i en epifluorescenskonfigurasjon der den samme objektive linsen brukes til både eksitasjon og innsamling av det avgitte lyset. Eksitasjonslyset har en bølgelengde på mellom 340 nm og 380 nm, og et fotomultiplierrør (PMT) måler det avgitte lyset med en bølgelengde på 510 nm. Et par dikroiske speil gjør det mulig for disse to optiske banene å dele samme fysiske fotavtrykk uten å forstyrre motsatt måling (figur 2). Til slutt bruker OCT bredbåndslys (100 nm spektral bredde) med en sentral bølgelengde på 840 nm, forskjellig fra de to andre modalitetene. På grunn av lysets lave sammenheng som brukes til OCT, vil ikke spredt lys fra brightfield-fluorescenskildene bidra til interferensmønsteret som koder dybdeinformasjon. For det andre kravet har boligdesignet for kapillærrøret tilgjengelige optiske veier til de fremre, dårligere og overlegne planene i prøven. Under eksperimenter holder to platinakroker en trabecula i et kapillærrør som er perfundert med oksygenert Krebs-Henseleit (KH) løsning. Galvanometerhodet til OCT er orientert ortogonalt til brightfield-fluorescensavbildningsveien for å dra nytte av det tredje ortogonale optiske planet (figur 3).
Dette dokumentet skisserer designhensynene for å bygge en enhet som er i stand til samtidig avbildning av kalsium, sarkomerlengde og muskelgeometri. For å demonstrere disse målemulighetene beskriver vi prosessen med å isolere en ventrikulær trabecula, utarbeidelsen av de nødvendige bufferløsningene, sammen med de kritiske trinnene som er involvert i håndtering og fluorescensbelastning av en ex vivo trabecula. Til slutt skisserer dette dokumentet prosessene som kreves for å oversette datasettet til mer nyttige visualiseringer.
I denne studien presenterer vi en konfigurasjon som gjør det mulig å montere tre optiske systemer som kombinerer brightfield, fluorescens og OCT-avbildning for å samle inn data fra en aktivt kontraherende ex vivo hjertetrabecula (figur 1 og figur 2). En slik orkestrert integrasjon er mulig på grunn av utformingen av målekammeret (figur 3) for å muliggjøre det ortogonale arrangementet av OCT til brightfield-fluorescensaksen. Muskelmonteringssystemet spiller en like viktig rolle i suksessen med samtidige kvantifiseringer av viktige indekser i karakterisering av hjertemuskeleksitasjons-sammentrekningsdynamikk. Nyheten ligger i å muliggjøre muskelskanningsprosedyrer uten tilsynelatende forstyrrelser i muskelens mekaniske ytelse (figur 6). Med den kombinerte bildekonfigurasjonen og motorisert kroksystem for kraftmåling, kan dette systemet evaluere regional heterogenitet i Ca2+ forbigående, forskyvning og sarkomerlengde, sammen med makroskopisk geometrisk informasjon om en kontraherende trabecula gjennom hele rykningen (Figur 7 og Figur 8).
Gitt allestedsnærværende brightfield-epifluorescence bildesystemer innen hjerteforskningslaboratorier, kan reproduksjonen av disse resultatene oppnås med noen mindre maskinvarehensyn. Her presenterer vi bildebehandlingsverktøysettet for å kombinere brightfield-epifluorescence og OCT, noe som er viktig for å analysere den underliggende kontraktile heterogeniteten. Integrasjonen av Oct krever en uhindret optisk bane, mens den inngjerdede avbildningen krever en ekstern utløserlinje mellom stimulansen og både OCT og brightfield bildekamera, og muskelmonteringskroker som er i stand til å flytte prøven gjennom målekammeret. Den nødvendige etterbehandlingsprogramvaren og metodene er fritt tilgjengelige. Spesielt er segmenteringsprogramvaren som brukes, WEKA14, åpen kildekode. Teknikken for markørløs sporing av materialpunkter8, sarcomere lengde, inngjerdet volumetrisk bildebehandling10og mesh-generasjonskoder er like tilgjengelige og kan gjøres tilgjengelig på forespørsel fra den tilsvarende forfatteren.
Muskel levedyktighet, optimal lasting av Fura-2, og bildefokus er de tre søylene som danner grunnlaget for et vellykket eksperiment. Ved hjelp av en disseksjonsløsning som inneholder BDM for å forhindre kontraktur, transport av muskelen i en sprøyte, kontinuerlig oksygenering av løsningen og utarbeide nye eksperimentelle løsninger på dagen for et eksperiment, bidrar alle til høy muskel levedyktighet. Før du laster trabecula med Fura-2AM, må autofluorescence samles inn for hver tilstand man er interessert i å studere, da det kan ha en betydelig effekt på den målte Ca2 + forbigående15. Oksygenering av Fura-2AM lasteløsning er komplisert ved nødvendig inkludering av overflateaktiv pluronic-F127 for å hjelpe fargestoffbelastning. For å bekjempe den resulterende overflødige bobleformasjonen forårsaket av dette overflateaktive middelet, gjør en liten dråpe anti-skum i lasteløsningen brukeren i å øke oksygeneringshastigheten, og dermed forbedre sjansen for at trabecula opprettholder funksjonell levedyktighet gjennom hele lastingsprosessen. Til slutt må bildefokuset være jevnt langs muskellengden for å maksimere signal-til-støy-forholdet mellom brightfield- og fluorescensinformasjonen.
Det er to begrensninger å vurdere med metodene som presenteres her. Først er den romlige oppløsningen av fluorescensmikroskopet. Mens de romlige oppløsningene til OCT og brightfield-avbildningen er høye, er oppløsningen av fluorescensmikroskopet begrenset til integralet av fluorescensen fra volumet som er fanget innen et 540 μm ved 540 μm bildevindu. Det er romlig oppløsning av fluorescensmikroskopet ved å bruke et høy-gain ladekoblet enhetskamera, i stedet for en PMT, for å fange fluorescenssignalet på bekostning av signal-til-støy-forholdet16. For det andre er diameteren på trabecula som kan studeres når det gjelder målbar sarkomerlengde og geometrisk dybde. Den vindusbaserte FFT-tilnærmingen for databehandling av sarcomere-lengde utnytter fordelen med forbedret romlig oppløsning, men er forbundet med redusert robusthet (Figur 8D). I tilfeller der turbid eller stor diameter trabeculae skal studeres, vil solvensen av FFT bli sterkt redusert på grunn av den reduserte kontrasten forbundet med sarkomerisk banding i større vevsprøver. På samme måte, i Oct, vil bakrefleksjonene fra en bildedybde på mer enn 300 μm være for svake til å løses i segmenteringsfasen. Derfor er teknikken vår begrenset til trabeculae av en diameter mindre enn 300 μm. Det anbefales imidlertid ikke å studere prøver med stor diameter, da det kan være problemer med diffusiv oksygenering av muskelkjernen under høye stimuleringshastigheter17.
Vår metode muliggjør vurdering av ionisk mekanisk funksjon i forbindelse med muskelgeometri i sunn og syk muskel, noe som gir en kraftig tilnærming til å forstå hjertemuskelfysiologi, patofysiologi og farmakologi. Bildebehandlingssamlebåndet som er skissert her, trekker ut data som vil være avgjørende for å få en dypere forståelse av kontraktil heterogenitet. En mulighet til å fullt ut realisere potensialet til et så rikt datasett er i byggingen av matematiske modeller som integrerer og tolker disse dataene, og å lage spådommer som kan testes eksperimentelt ved hjelp av enheten vår.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble finansiert av Doktorgradsstipend fra University of Auckland (tildelt JD og MC), Sir Charles Hercus Health Research Fellowships (20/011 og 21/116) fra Health Research Council of New Zealand (tildelt J-CH til KT, henholdsvis), et doktorgradsstipend tildelt av National Heart Foundation (tildelt AA), Marsden Fast-Start-tilskudd (UOA1504 og UOA1703) fra Royal Society of New Zealand (tildelt J-CH og KT, henholdsvis), og et James Cook Research Fellowship fra Royal Society of New Zealand (tildelt AT). Den opprinnelige utviklingen av dette instrumentet ble finansiert av et Marsden-stipend (11-UOA-199) fra Royal Society of New Zealand (tildelt AT og PN).
2,3-Butanedione monoxime | Acros Organics | 150375000 | |
20× microscope lens | Nikon | CFI Super Fluor 20× | NA 0.75 |
2D Galvanometer | Thorlabs | GVSM002/M | |
50-50 beam splitter | Thorlabs | FC850-40-50-APC | |
90-10 beam-splitter | Thorlabs | TW850R2A2 | |
Analogue input module | National Instruments | NI-9205 | Records the PMT signal at 200 kHz |
Brightfield imaging light source | CoolLED | PE-2 | 660 nm LAM |
Broadband light source | Superlum | Broadlighter-840 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
Cameralink card | National Instruments | NI-1429 | Brightfield imaging frame grabber |
Carbogen 5 | BOC | Gas code: 181 | |
Condensor lens | Nikon | LWD 0.52 | |
D(+)-Glucose | Merck | 108337 | |
DAQ | National Instruments | NI-6259 | Triggers the galvanometer movement |
Dichroic mirror 1 | Semrock | FF409-Di03 | |
Dichroic mirror 2 | Semrock | FF552-Di02 | |
Diffraction grating | Wasatch Photonics | 1200 lines/mm @840 nm | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
Direct-Q 3 UV System | Merck Millipore | ZRQSVR3WW | Distilled water machine |
Dry bath | Corning | 6875-SB | LSE digital dry bath |
FIJI | ImageJ | Open-source image processing software | |
Fura-2AM pentapotassium salt | Thermofisher | F14186 | |
Hardware FPGA card | National Instruments | NI-7813R | Also controls the triggering of the brightfield capture |
Heparin | Pfizer | 61024 | |
HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
Inverted microscope | Nikon | TI-DH illumination pillar | |
Isofluorane | MedSource | VAPDRUGISO250 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Line-scan camera | Basler | spL2048-70km | Spectrometer camera |
Magnetic stirrer | IKA | 3810000 | RCT basic |
Matlab | Mathworks | Data processing code | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
NaH2PO4.2H2O | Sigma-Aldrich | 71505 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
OCT FPGA card | National Instruments | NI-1483R | |
Oxygen tank | BOC | Gas code: 100D | |
pH meter | Mettler Toledo | MP220 | |
Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422-20 | |
Powerload | Thermofisher | P10020 | |
Superluminescent diode | Broadlighter | D-840 | |
Transimpedance amplifier | Custom | ||
Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
Wistar rat | Vernon Jansen Unit | 8 – 10 weeks | |
Xenon arc lamp | Sutter Instrument | DG-4 | Lambda DG-4 |