Imágenes tomográficas simultáneas de campo brillante, fluorescencia y coherencia óptica de trabéculas cardíacas contacciones ex vivo

Summary

Este protocolo presenta una colección de datos geométricos de sarcómeros, calcio y macroscópicos de una trabécula cardíaca que se contrae activamente ex vivo. Estas mediciones simultáneas son posibles gracias a la integración de tres modalidades de imagen.

Abstract

En el músculo cardíaco, los transitorios intracelulares de Ca²⁺ activan los miofilamentos contráctiles, causando contracción, acortamiento macroscópico y deformación geométrica. Nuestra comprensión de las relaciones internas entre estos eventos ha sido limitada porque no podemos “ver” dentro del músculo ni rastrear con precisión la naturaleza espacio-temporal de la dinámica de excitación-contracción. Para resolver estos problemas, hemos construido un dispositivo que combina un conjunto de modalidades de imagen. Específicamente, integra un microscopio de campo brillante para medir los cambios locales de la longitud del sarcómero y la tensión del tejido, un microscopio de fluorescencia para visualizar el transitorio de Ca^{2 +} y un tomógrafo de coherencia óptica para capturar los cambios geométricos del tejido a lo largo del curso temporal de un ciclo cardíaco. Presentamos aquí la infraestructura de imágenes y el marco de recopilación de datos asociado. Los datos se recopilan de estructuras tisulares aisladas en forma de varilla conocidas como trabeculae carneae. En nuestro instrumento, un par de ganchos de platino controlados por posición sostienen cada extremo de una muestra muscular ex vivo mientras se superpone continuamente con una solución salina rica en nutrientes. Los ganchos están bajo control independiente, lo que permite el control en tiempo real de la longitud y la fuerza muscular. La traducción longitudinal permite el escaneo por partes de la muestra, superando las limitaciones asociadas con el tamaño relativo de la ventana de imágenes del microscopio (540 μm por 540 μm) y la longitud de una trabécula típica (>2000 μm). Los electrodos de platino en cada extremo de la cámara muscular estimulan la trabécula a una velocidad definida por el usuario. Explotamos la señal de estimulación como un disparador para sincronizar los datos de cada ventana de imágenes para reconstruir toda la muestra de contracción en condiciones de estado estacionario. La aplicación de técnicas de procesamiento de imágenes a estos datos de imágenes de campo brillante proporciona mapas de desplazamiento de tejidos y longitud de sarcómeros. Tal colección de datos, cuando se incorpore a una tubería de modelado de experimentos, proporcionará una comprensión más profunda de la homogeneidad y heterogeneidad contráctil muscular en fisiología y fisiopatología.

Introduction

La superfusión de preparaciones aisladas de tejido muscular cardíaco es un protocolo estándar y ampliamente utilizado para estudiar la activación y mecánica iónica cardíaca¹. En particular, el aislamiento de trabéculas, estructuras en forma de bastón de las paredes ventriculares, ha permitido la evaluación de fenómenos que incluyen la activación dependiente de la longitud de la contracción^2,la respuesta dependiente del estiramiento de la contracción^3,4y la viscoelasticidad diastólica⁵ del tejido cardíaco. Ter Keurs, el iniciador de esta técnica de sobrefusión de trabéculas aisladas, utilizó inicialmente una combinación de imágenes de fluorescencia para mediciones de Ca²⁺ y difracción láser para determinar longitudes de sarcómeros^2,5. Desde estos primeros estudios, se ha vuelto cada vez más común extraer información de longitud de sarcómero con una mayor resolución espacial utilizando técnicas basadas en la transformada de Fourier rápida 2D^(FFT)6 en imágenes de microscopía de campo brillante. Los dos sistemas de imágenes permiten una evaluación parcial de la relación subyacente entre la liberación de Ca²⁺ y la producción de fuerza dependiente de la longitud del sarcómero.

El músculo cardíaco es estriado, con las bandas visibles asociadas con una serie subyacente de unidades contráctiles que consisten en filamentos gruesos y gruesos. La interacción de estos filamentos constituyentes que componen los sarcómeros subyace a la generación de fuerza, que comienza de la siguiente manera: una señal eléctrica despolarizante, o potencial de acción, hace que se abran los canales de Ca²⁺ de tipo L dependientes del voltaje en la membrana celular; la consiguiente afluencia celular de Ca²⁺ induce la liberación de Ca²⁺ del retículo sarcoplásmico (SR), un almacén intracelular de Ca^2+, en un proceso conocido como Ca²⁺inducido por Ca²⁺ liberación^7; este aumento repentino en la concentración intracelular de Ca²⁺ del rango nanomolar al micromolar permite que se produzca la producción de fuerza; Las bombas de Ca²⁺ extruyn continuamente Ca²⁺ del citosol hacia el sr y el compartimento extracelular; cuando la concentración intracelular de Ca²⁺ vuelve al rango nanomolar, cesa la producción de fuerza y el músculo se relaja. Durante la producción de fuerza, los filamentos gruesos y delgados constituyentes se deslizan unos sobre otros. La longitud del sarcómero dicta la extensión relativa de la superposición y, por lo tanto, el potencial de producción de fuerza del músculo macroscópicamente.

En este artículo, ampliamos estas técnicas de imagen de campo brillante de fluorescencia para incluir la tomografía de coherencia óptica (OCT). La OCT utiliza el principio físico de interferencia y es capaz de obtener la deformación geométrica del tejido para comprender la heterogeneidad contráctil muscular⁸. Nuestro dispositivo (Figura 1) utiliza un sistema OCT de dominio espectral (SD-OCT). En SD-OCT, un divisor de haz divide la luz de un diodo superluminiscente de banda ancha de corta longitud de coherencia en brazos de referencia y medición. El brazo de referencia contiene un espejo fijo, y el brazo de medición contiene un galvanómetro 2D para dirigir la luz. La luz retroresmada de la muestra se recoge e interfiere con la luz reflejada en el brazo de referencia para formar un patrón de interferencia. La información de profundidad está codificada en la frecuencia de la franja espectral. Para extraer la información, la señal se pasa a través de un espectrómetro y se aplica un FFT inverso al resultado. La señal 1D correspondiente representa las estructuras a diferentes profundidades, correspondientes a cambios en el índice de refracción⁹ (A-scan). Al dirigir el láser en un solo eje, se puede construir una sección transversal de la muestra de interés (B-scan) y, de manera similar, al repetir el proceso en un patrón paso a paso en el eje restante, se puede generar una imagen tridimensional (C-scan). Por extensión, se pueden recopilar una serie de escaneos B en un solo corte para un sujeto variable en el tiempo repetitivo basado en un disparador externo y repetir para generar un escaneo tridimensional, que representa una imagen plana variable en el tiempo¹⁰.

Al integrar los tres sistemas de imágenes, hemos considerado los siguientes dos principios. En primer lugar, los sensores de imagen no deben detectar la luz de una modalidad de imagen alternativa, y en segundo lugar, el diseño físico debe contener espacio libre para al menos tres planos de imagen simultáneos. Para abordar el primer requisito, el microscopio de campo brillante utiliza un LED de longitud de onda de 660 nm para iluminar la muestra en una configuración invertida. El microscopio de fluorescencia está en una configuración de epifluorescencia donde se utiliza la misma lente objetivo tanto para la excitación como para la recolección de la luz emitida. La luz de excitación tiene una longitud de onda de entre 340 nm y 380 nm, y un tubo fotomultiplicador (PMT) mide la luz emitida a una longitud de onda de 510 nm. Un par de espejos dicroicos permiten que estas dos rutas ópticas compartan la misma huella física sin interferir con la medición opuesta(Figura 2). Finalmente, la OCT utiliza luz de banda ancha (ancho espectral de 100 nm) con una longitud de onda central de 840 nm, distinta de las otras dos modalidades. Debido a la naturaleza de baja coherencia de la luz utilizada para la OCT, cualquier luz dispersa de las fuentes de fluorescencia de campo brillante no contribuirá al patrón de interferencia que codifica la información de profundidad. Para el segundo requisito, el diseño de la carcasa para el tubo capilar tiene vías ópticas accesibles a los planos anterior, inferior y superior de la muestra. Durante los experimentos, dos ganchos de platino sostienen una trabécula dentro de un tubo capilar perfundido con solución oxigenada de Krebs-Henseleit (KH). La cabeza del galvanómetro de la OCT está orientada ortogonalmente a la vía de imagen de fluorescencia de campo brillante para aprovechar el tercer plano óptico ortogonal(Figura 3).

Este documento describe las consideraciones de diseño para construir un dispositivo capaz de obtener imágenes simultáneas de calcio, longitud del sarcómero y geometría muscular. Para demostrar estas capacidades de medición, describimos el proceso de aislamiento de una trabécula ventricular, la preparación de las soluciones tampón necesarias, junto con los pasos críticos involucrados en el manejo y la carga de fluorescencia de una trabécula ex vivo. Finalmente, este documento describe los procesos necesarios para traducir el conjunto de datos en visualizaciones más útiles.

Protocol

El Comité de Ética Animal de la Universidad de Auckland aprobó el manejo de ratas y la preparación de muestras de tejido. 1. Calibración de imágenes Calibración de píxeles de microscopio de campo brillante Llene la cámara de medición con agua destilada. Coloque una rejilla de difracción con líneas conocidas por μm en la cámara de medición. Pulse F1 para habilitar la captura y ajustar la velocidad de fotogramas [Hz] hasta que la rejilla de difracción sea claramente visible (Figura 4A). Asegúrese de que la rejilla de difracción corra paralela al borde del marco. Presione F1 nuevamente para detener la captura. Establezca el total de imágenes en Capturar en uno, presione Ctrl + Mayús + S para transmitir datos al disco y presione F1 para capturar una imagen de la rejilla de difracción. Abra ImageJ e importe la imagen de rejilla de difracción (Archivo > Abrir > Seleccionar imagen de calibración). Manteniendo presionado el desplazamiento, dibuje una línea que abarque 20 bandas claras y oscuras de la rejilla de difracción. Calibrar la imagen (Analizar > Establecer escala). La longitud de la línea del paso 1.1.5 establece el valor Distancia en píxeles. Establezca el valor de Distancia conocida en 20 veces las líneas por μm de medición y la Unidad de longitud en μm. El inverso de la escala es el número de micrómetros representado por un píxel. Calibración de resolución de profundidad OCT Mida el grosor de un portaobjetos de microscopio de vidrio con pinzas Vernier. Encienda la fuente láser OCT. Cubra el cabezal del galvanómetro y haga clic en Obtener BG para medir el patrón de interferencia de fondo y restarlo de la medición (Figura 4B). Sujete el portaobjetos de microscopio de vidrio medido (del paso 1.2.1) en el brazo de medición de la OCT. Haga clic en Transmisión en vivo para ver la imagen de oct. Ajuste el portaobjetos del microscopio de vidrio hasta que sea visible dentro de la exploración B. Para capturar la imagen de escaneo B, establezca rango Y (pasos) en uno, haga clic en Transmitir datos de escaneo B?y haga clic en Adquirir. Importe la imagen B-scan en ImageJ (File > Open > Select B-scan). Manteniendo presionado el desplazamiento, dibuje una línea entre los límites del portaobjetos de microscopio de vidrio. Establecer la escala (Analizar > Establecer escala). Establezca Distancia conocida en la medición recogida en el paso 1.2.1. Para calcular la resolución de profundidad en el aire, corrija el índice de refracción de la diapositiva del microscopio (nvidrio = 1.5175)11 multiplicando el valor de medición por píxel por nvidrio.NOTA: El vidrio n citado es para vidrio de borosilicato. Los portaobjetos de microscopio se pueden hacer de diferentes materiales. Utilice el índice de refracción apropiado para la diapositiva medida. Para escalar la resolución de profundidad del miocardio, divida el valor del paso 1.2.9. por nmiocardio = 1,38 (valor reportado previamente12). 2. Preparación de muestras musculares Prepare la plataforma de disección. Vierta un poco de la solución de disección (descrita en la Tabla 1)en un tazón de metal pequeño y colóquela en el congelador aproximadamente una hora antes de la escisión cardíaca. Configure una plataforma de disección que garantice que la solución de disección esté bien oxigenada (100% de oxígeno) y se haya lavado a través de cada una de las líneas de tubería. Llene la cámara de disección con solución de disección oxigenada y ate libremente la sutura 3/0 alrededor del catéter de perfusión. Extirpa el corazón. Anestesiar ratas Wistar de 8-10 semanas de edad usando isoflurano gaseoso (< 5% en oxígeno). Confirme la anestesia pellizcando la cola. Coloque la rata anestesiada en posición supina e inyecte por vía subcutánea en el área abdominal con solución de heparina (1000 UI/kg). Mantenga la anestesia durante cinco minutos más para permitir que la heparina circule. Recupere el recipiente de metal que contiene la solución de disección del congelador y colóquelo cerca del banco de eutanasia.NOTA: Evite congelar la solución de disección por completo para permitir la inmersión completa del corazón disección. Transfiera la rata anestesiada al banco de eutanasia y eutanasia por luxación cervical. Abra el pecho de la rata con tijeras, primero cortando la pared del cuerpo a lo largo de la parte inferior de la caja torácica, luego el diafragma, antes de proceder a lo largo de los bordes laterales de la caja torácica. Levanta el pecho fuera del camino. Agarra el corazón con una mano mientras que la otra mano usa un par de tijeras curvas para cortar los vasos de conexión (aorta, vena cava, etc.). Sumersa rápidamente el corazón en la solución de disección fría. Aislar una trabécula. Identifique la aorta mientras el corazón está en el recipiente de metal, luego transfiera el corazón a la cámara de disección. Usando dos forrceps curvas, tire de la aorta sobre la cánula de perfusión. Sostenga la aorta en su lugar con un portemplo. Mientras tanto, abra la línea de tubería para permitir que la solución de disección fluya a través de la cánula de perfusión.NOTA: Trate de completar la perfusión dentro del minuto siguiente a la escisión cardíaca. Una vez que la vasculatura coronaria se limpia de sangre y el corazón está completamente perfundido con la solución de disección, detenga el flujo de perfusión y asegure la aorta en su lugar usando la sutura. Vuelva a encender el flujo y perfunda el corazón canulado. Gire la cánula para que la arteria coronaria izquierda sea visible en la superficie superior. Fije el ápice del corazón a la parte inferior de la cámara de disección(Figura 5A). Cortar ambas aurículas (Figura 5B). Con un juego de tijeras de resorte, corte a lo largo del lado derecho del tabique hasta el ápice del corazón (como se indica en la Figura 5B). Fije el ventrículo izquierdo abierto a la base de la cámara de disección. Luego corte a lo largo del lado izquierdo del tabique, abra el ventrículo derecho y fije también a la base de la cámara de disección(Figura 5C).NOTA: Para fijar los ventrículos en una posición abierta, algunos músculos papilares tendrán que ser cortados. Identificar una trabécula de carrera libre en el ventrículo derecho (Figura 5D-E). Usando la tijera de resorte y un forrórceps, corte el tejido de la pared que rodea la trabécula, luego corte el tejido de la pared por la mitad ortogonalmente a la dirección de la trabécula. Recorte el tejido de la pared hasta que su dimensión sea adecuada para la configuración de montaje utilizada. En este caso, aproximadamente la mitad del tamaño de una semilla de sésamo (Figura 5F).NOTA: Las trabéculas se pueden diseccionar de los ventrículos derecho e izquierdo, pero las de la izquierda suelen ser más turbias y menos aplicables para las mediciones de sarcómeros y geometría. Deje la trabécula extirpada en la cámara de disección, superfundiendo continuamente con la solución de disección. 3. Protocolo experimental NOTA: El dispositivo13 utilizado para este experimento se construyó internamente y utiliza código de control personalizado. Las consideraciones necesarias para el diseño de un dispositivo construido para replicar estos datos son dos ganchos de montaje accionados de forma independiente, una cámara de medición con tres ejes ópticamente claros(Figura 3)y una línea de disparo externa que sincroniza las cámaras de campo brillante y OCT con el estimulador. El voltaje PMT y la señal de fuerza se recolectaron utilizando tarjetas DAQ analógicas, las imágenes de la OCT y el microscopio de campo brillante se recolectaron utilizando tarjetas de captura de fotogramas Camera Link, y la señal de estímulo se recopiló utilizando una tarjeta de E/ S digital. Los datos se almacenaron fuera de línea utilizando un conjunto de bucles de consumo del productor para mantener la alineación temporal. Preparar el cardiomiómetro. Enjuague el agua caliente (~ 60 ° C), el agua destilada (temperatura ambiente) y luego la solución de superfusado a través de la cámara de medición. Bubblear continuamente la solución de superfusato con carbógeno. Encienda la fuente de iluminación del microscopio de campo brillante y presione F1 para habilitar la captura(Figura 4A). Ajuste manualmente el gancho aguas abajo hasta que esté centrado en la imagen de campo brillante. Haga clic en Eje descendente ceroy, a continuación, en Desactivado descendente para habilitar el motor ( Figura4C). Mueva el control deslizante Punto de ajuste de DS [um] hasta que el final del gancho se alinee con el borde de la región predeterminada de interés. Vuelva a poner a cero el eje descendente y, a continuación, mueva el control deslizante DS Setpoint [um] a 1000. Repita el proceso con el gancho ascendente, pero no mueva el control deslizante US Setpoint [um]. Haga clic en Mover a montaje ( Figura4C). Inicie el sistema de iluminación de fluorescencia alternando el interruptor de la lámpara antes de encender rápidamente los subsistemas del controlador alternando el interruptor principal. NOTA: Algunas fuentes de luz UV producen grandes cantidades de ozono. Si este es el caso, conecte un extractor de ozono a la ventilación de salida de la fuente de luz y asegúrese de que esté funcionando antes de encender la fuente de iluminación de fluorescencia. Cambie el modo de funcionamiento a Turbo-Blanking presionando el botón Modo en el panel frontal, seguido de 2 , luego 1. Pulse el botón En línea para permitir que el código de control informe el funcionamiento. Monte la trabécula. Pausar el flujo de superfusado a través de la cámara de medición. Llene la cámara de montaje con la solución de disección. Usando una jeringa de 1 ml, transporte la trabécula desde la cámara de disección hasta la cámara de montaje (Figura 5G). Para transferir la trabécula, coloque la jeringa verticalmente y en contacto con la superficie de la solución de la cámara de montaje. Permita que la trabécula descienda a la cámara de montaje por gravedad(Figura 5H). Baje el nivel de fluido en la cámara de montaje para que esté al nivel de la sección media de los ganchos. Ajuste la distancia entre los ganchos para reflejar la longitud de holgura de la trabécula moviendo el control deslizante DS Setpoint [um]. Usando un microscopio para ayudar a la visualización, agarre ligeramente una de las piezas de tejido final con forrceps y móntela en el gancho aguas arriba. Monte la otra pieza de tejido final en el gancho aguasabajo (Figura 5I). Una vez montada de forma segura, mueva la trabécula de nuevo a la cámara de medición (Figura 5J) pulsando Mover a la cámara ( Figura4C). Reanude el flujo de superfusado y la extracción de fluidos. Establezca la frecuencia del estímulo [Hz] en 1, la duración del estímulo [ms] en 10 y el voltaje del estímulo en 10. Comience la estimulación presionando Stimulus On?. Preparar la trabécula. Después de aproximadamente 1 h de aclimatación, disminuya gradualmente el voltaje del estímulo y la duración del estímulo en pasos de 1 V y 1 ms, respectivamente. Un conjunto típico de valores es de 3 V y 3 ms. Encienda el sistema de iluminación de campo brillante. Presione F1 y seleccione una región de interés que encierra un área estriada en la interfaz de usuario. Haga clic en Compute SL? para calcular la longitud media del sarcómero en la región resaltada. Aumente la longitud muscular hasta que la longitud promedio del sarcómero sea de 2,32 μm aumentando el control deslizante Punto de ajuste de separación [um].NOTA: ¿Compute SL? utiliza un FFT 2D descrito en el paso 4.3. La región de interés utilizada para calcular la longitud media del sarcómero es típicamente de 100 μm a 150 μm cuadrados. Por lo tanto, a medida que el músculo se acerca a la longitud óptima del sarcómero, se utilizan de 43 a 65 sarcómeros para calcular la longitud promedio del sarcómero. Mueva el músculo ajustando el control deslizante Punto de ajuste central [um] en la pestaña “Control de centro y separación (Figura 4C) para que el borde del gancho aguas abajo sea visible dentro de la imagen de campo brillante. Recopile la información de fluorescencia para diez contracciones. Aumente el valor del punto de ajuste central [um] en 200 y recopile otras diez contracciones de información de fluorescencia. Repita este proceso hasta que la imagen de campo brillante contenga el gancho aguas arriba. Recopile el valor de la ventana final de información de fluorescencia. Devuelva la trabécula a una posición central estableciendo el valor del punto de ajuste central [um] en 0. Reduzca la frecuencia de estímulo a 0,2 Hz y cambie del superfusado KH a la solución de carga Fura-2 (detallada en la Tabla 1). Mida la señal de fluorescencia cada 10 minutos haciendo clic en Habilitar fuente de fluorescencia en la pestaña Stim y datos. Visualice la señal de fluorescencia en la pestaña Señal PMT. Después de que la señal de 360 nm haya aumentado en un factor de 10 o la duración del procedimiento de carga haya excedido las 2 h, devuelva la frecuencia de estímulo a 1 Hz y vuelva a la solución de superfusado KH. Verifique la medición de la relación cada 10 minutos hasta que la medición de la relación se estabilice, momento en el que puede comenzar la recopilación de datos. Recopile datos de imágenes de campo brillante y fluorescencia. Devuelva el músculo a la posición donde el borde del gancho aguas abajo está presente dentro de la imagen de campo brillante. Comience a transmitir datos de hardware haciendo clic en Transmitir datos al disco en la pestaña Stim y datos de la interfaz de usuario de control de hardware. Capture la información de fluorescencia haciendo clic en Habilitar fuente de fluorescencia. En la interfaz de usuario de imágenes de campo brillante, establezca el modo de captura en un disparador externo, aumente la velocidad de fotogramas a 100 Hz y establezca el número de imágenes que se capturarán en 100. Presione Ctrl + Mayús + S seguido de F1 para registrar los datos de imágenes de campo brillante para esta ventana. Aumente el valor del punto de ajuste central [um] en 200 y repita el paso 3.4.2. Continúe con el protocolo de escaneo hasta que se hayan recopilado los datos de imagen para la ventana final del Paso 3.3.4. Devuelva la trabécula a una posición central estableciendo el valor del punto de ajuste central [um] en 0. Recopile datos de imágenes de OCT. Encienda la fuente láser OCT girando la tecla maestra a la | , presionando el botón de encendido, seguido del botón SLDs. Cubra el cabezal del galvanómetro y haga clic en Obtener BG para medir el patrón de interferencia de fondo y restarlo de la medición (Figura 4B). Establezca el modo de captura de imágenes en live-view. Ajuste la posicióny -hasta que la imagen B-scan contenga solo el gancho ascendente. Divida la longitud muscular que se muestra en el panel frontal de control(Figura 4B)por dos y reste la posición yactual. Introduzca este valor en la entrada”y-offset”. Ajuste el valor”x-offset” hasta que la sección transversal de la trabécula esté centrada en el marco. Con la trabécula centrada, escanee a lo largo del eje yajustando la posición y-para encontrar las posiciones correspondientes a los ganchos aguas arriba y aguas abajo. Tenga en cuenta estas posiciones hacia abajo. Establezca el rango Y (pasos) en la diferencia absoluta entre estos valores divididos por diez. Establezca el modo de captura de imagen en Stimulus Triggered?, Rango X (pasos) en 100 y haga clic en el botón Establecer parámetros activos. Haga clic en Stream B-Scan Data?y, a continuación, en Adquirir.NOTA: El protocolo de imágenes cerradas requiere 200 contracciones para capturar toda la geometría muscular de una muestra de 2 mm de longitud, lo que corresponde a un tiempo de captura de ~ 3 min 20 s. 4. Procesar el conjunto de datos de imágenes de campo brillante Preparar las imágenes para su análisis. Importar imágenes en ImageJ (Archivo > Importar > secuencia de imágenes > Seleccionar imagen). Aumentar el contrastede la imagen (> Ajustar > los controles deslizantes Brillo/Contraste > Mover mínimo y Máximo para centralizar el histogramade la imagen). Agudizar las imágenes (Filtros de > de proceso > Máscara de > establecer Radio (Sigma) en 1.0 píxeles y Peso de máscara (0.1-0.9) en 0.6). Exporte la secuencia de imágenes(Guardar como > Secuencia de imágenes > Establezca el formatoen PNG , Comience en 0 y Dígitos (1-8) en 4). Cose las imágenes, mida el desplazamiento localizado y calcule las longitudes locales del sarcómero. Abra “TrabeculaProcessing.m” (disponible a petición) y establezca la variable FolderPath en la carpeta principal que contiene todos los datos, e ImagePath en la carpeta donde se guardó la secuencia de imágenes del paso 4.1.4. Establezca secciones en el número de ventanas de imágenes y fotogramas en el número de fotogramas capturados por ventana. Ejecute el código.NOTA: Las salidas estarán presentes en la ruta de la carpeta de salida especificada por el usuario. (De forma predeterminada, la ruta se establece en FolderPath/Output). Técnica de longitud del sarcómero FFT Utilice un software de procesamiento de imágenes para realizar un FFT en una región de la imagen donde los sarcómeros son altamente visibles. Multiplique los píxeles por μm de los resultados de calibración del paso 1.1.6 por 1,6 μm y 3,0 μm antes de calcular el inverso para obtener el rango de frecuencias espaciales de interés. Ajuste un exponencial al resultado FFT, ignorando la información de frecuencia en el rango de frecuencia calculado en el paso 4.3.2, y reste el resultado de la transformación para eliminar el término DC. Ajuste una curva gaussiana a la banda de frecuencia de interés. Calcula el inverso del pico de la curva gaussiana. Esta es la longitud promedio del sarcómero para la región de interés.NOTA: El cálculo FFT y el ajuste de las ecuaciones exponenciales y gaussianas se realizaron utilizando código LabVIEW personalizado. 5. Procesar los datos de fluorescencia Reste la autofluorescencia dependiente de la ventana de la ventana respectiva y calcule el cociente de las señales asociadas con las longitudes de onda de excitación de 340 nm y 380 nm. 6. Procesar los datos de imágenes de OCT Prepare el conjunto de imágenes de OCT para la segmentación. Abra ImageJ e importe las imágenes (Archivo > Importar > secuencia de imágenes). En la ventana del explorador de archivos, se abre, localice las imágenes, seleccione una y haga clic en Abrir.Nota : si el código de control para la OCT no almacena las imágenes en un formato que sea legible por ImageJ, conviértalas a PNG. Para facilitar la visualización, organice la secuencia de imágenes en un hyperstack (Image > Hyperstacks > Stack to Hyperstack). En el cuadro de diálogo que se abre, establezca el número de sectores en el número de exploraciones B por sector y la X en el número de sectores a lo largo de la longitud de la trabécula. Dibuja un rectángulo que encierra la trabécula. Confirme que encierra todo el volumen a través del tiempo mediante los controles deslizantes de la ventana hyperstack. Recorte la imagen a la ventana (Imagen > Recortar). Retire los sectores que contienen imágenes de los ganchos de montaje (Stacks > Tools > Slice Keeper). Seleccione el rango de sectores que contiene solo información de trabécula. Segmentación WEKA de trenes. Segmentación WEKA abierta (Plugins > Segmentación > Segmentación Weka entrenable). Establezca el modo de selección en Freehand. Haga clic en Configuración y ajuste el clasificador y la configuración de entrenamiento. (Para este modelo, se utilizaron las siguientes características de entrenamiento: desenfoque gaussiano, filtro de Sobel, hessiano, diferencia de gaussianos, proyecciones de membrana, bilateral y Lipschitz. El grosor de la membrana se estableció en 1, el tamaño del parche de membrana en 8, el sigma mínimo en 1 y el sigma máximo en 32. El clasificador se estableció en FastRandomForest y las opciones del clasificador se establecieron en: batchSize 100, maxDepth a 32, numFeatures a 32, numThreads a 0 y numTrees a 200.) Segmentar manualmente las imágenes hasta que el entrenamiento resulte en segmentaciones satisfactorias. Guarde el clasificador. Segmentar los escaneos B procesados Inicie la segmentación WEKA siguiendo el paso 6.2.1. Cargue el clasificador desde el paso 6.2.5. Haga clic en Crear resultado. Convierta las imágenes a 8 bits (Image > Type > 8-bit). Convertir las imágenes a binario (Proceso > binario > Hacer binario > método predeterminado y fondo predeterminado). Guardar como secuencia de imágenes (PNG). Calcule el CSA promedio en las imágenes segmentadas de escaneo B. Cuente el número de píxeles blancos en una imagen binaria de escaneo B. Multiplique el área de píxeles por la resolución de profundidad calibrada (del paso 1.2) y 10 μm (la distancia entre los escaneos A vecinos). Repita para todos los escaneos B entre los ganchos y promedie las mediciones. Convertir imagen segmentada en una malla. Abra “OCTmain.m” (disponible bajo petición) y establezca imageDirectory en la carpeta que contiene la salida del paso 6.3.6. Establezca outputPath según sea necesario. Establezca sectores en el valor de “Rango Y (pasos)” (Paso 3.5.5) y fotogramas en el valor de “Repetir X” (Paso 3.5.6), z_dim a la resolución de profundidad (Paso 1.2.10) y x_dim y y_dim al valor asignado a 10. Haga clic en Ejecutar.

Representative Results

Para capturar la información regional de Ca2+ y campo brillante para toda la longitud de la trabécula presentada aquí, se requirieron siete posiciones musculares. La Figura 6 sugiere que la fuerza de contracción no fue perturbada por este movimiento, revelando que no había dependencia de la posición de la producción de fuerza activa. Las exploraciones B recogidas mediante tomografía de coherencia óptica a una velocidad de 100 Hz se segmentaron utilizando el plugin ImageJ WEKA14 (Figura 7A). Cada sección transversal aparece distorsionada debido a la diferencia entre las resoluciones lateral (10 μm) y de profundidad (1,73 μm (en miocardio)). Esta distorsión se corrigió escalando el eje de profundidad de la imagen mediante la relación resolución-profundidad lateral. La Figura 7B,C demuestra que después de escalar la exploración C en bruto de la trabécula es aproximadamente cilíndrica en geometría. La reflexión de la pared de la cámara de medición a veces puede superponerse con los datos musculares(Figura 7A,B),pero el software de segmentación se puede entrenar para dar cuenta de esto(Figura 7D,E). Una vez segmentada, el área de la sección transversal a lo largo de la longitud del músculo se puede calcular a lo largo de la contracción(Figura 7F). Tenga en cuenta que esta trabécula en particular tiene un pequeño apéndice que se ramifica desde ella. El movimiento de la rama es evidente ~ 0.75 mm a lo largo de la trabécula. Finalmente, las imágenes segmentadas se pueden convertir en mallas para ayudar a la construcción de modelos geométricos(Figura 7G). Los datos de imagen capturados en cada una de las diferentes posiciones de la trabécula a una velocidad de 100 fps se unieron para crear una sola imagen completa de la trabécula(Figura 8A). La resolución de estas imágenes es de 0,535 μm/píxel. El uso de funciones de ponderación lineal en las regiones superpuestas de las ventanas vecinas ayuda a la visualización y minimiza el impacto de la viñeta presente en las imágenes de campo brillante. Para medir la señal fluorescente, una ventana de 540 μm por 540 μm de la trabécula se ilumina cíclicamente con luz de longitud de onda de 340 nm, 365 nm y 380 nm a una velocidad de 600 Hz. La proporción de la fluorescencia emitida asociada con la luz de excitación de 340 nm y 380 nm se correlaciona con el calcio intracelular después de que la trabécula se haya cargado con Fura-2. Como esta medición es una relación, la tasa de medición efectiva es de 200 Hz. Los transitorios de Ca2+ intracelulares promediados(n = 10) de cada ventana están alineados con la región en la que fueron fotografiados (Figura 8B). Mientras que el pico de los transitorios parece razonablemente consistente, el diastólico [Ca2+] es menor dentro de la región entre 900 μm y 1800 μm a lo largo de la trabécula. Del mismo modo, los resultados de los cálculos de seguimiento de desplazamiento(Figura 8C)y longitud del sarcómero(Figura 8D)también indican la presencia de variabilidad regional. La técnica de seguimiento sin marcadores utilizada es capaz de procesar el desplazamiento de cada píxel, dado suficiente contraste. Al mapear la distribución de las longitudes de los sarcómeros en el post, se utilizó un área de correlación cruzada de 128 píxeles por 128 píxeles (~ 67 μm por 67 μm) para calcular la longitud regional del sarcómero. Esta área encapsula aproximadamente 29 sarcómeros cuando cerca de la muestra está cerca de la longitud óptima del sarcómero. El tamaño del paso (en las direcciones x e y)entre el centroide de cada ventana de correlación cruzada se estableció en 50 píxeles (~ 26 μm) para procesar estos datos. La idoneidad de las estimaciones de longitud del sarcómero se probó en función de la anchura y amplitud del ajuste gaussiano a la señal FFT. Estas condiciones no se cumplieron en la región muscular entre 0 μm y 500 μm, por lo que no se pudo calcular allí ninguna información sobre la longitud del sarcómero. Dados los desplazamientos asociados, es probable que los sarcómeros de esta región se alargaron durante la fase contráctil. De acuerdo con esta especulación, las longitudes promedio del sarcómero en el lado derecho de la trabécula se acortan durante ese período. Al combinar la información proporcionada por cada uno de los paneles, parece que la región con el área transversal más grande no produce la fuerza más significativa. Suponendo que la variación regional de los transitorios de Ca2+ tenga un gradiente aproximadamente suave, la Figura 8B indica que la mayor amplitud de Ca2+ transitoria ocurre en algún lugar entre 1300 μm y 1600 μm a lo largo de la trabécula. El mapa de desplazamiento indica que la región que sufre el menor movimiento se alinea bien con el pico Ca2+ transitorio. Sin embargo, esta región tiene las áreas transversales más pequeñas de la muestra. Con estos datos en mente, se podría inferir que esta región generó el mayor estrés. Figura 1: Imagen anotada del cardiomiómetro. Se describe cada uno de los principales componentes ópticos. El recuadro contiene un primer plano, retrovisor, del objetivo del microscopio in situ,debajo de la cámara de medición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Vía óptica para microscopía simultánea de campo brillante y fluorescencia. La fuente de iluminación para el microscopio de fluorescencia es una lámpara de arco de xenón, cuyo rendimiento cambia cíclicamente entre 340 nm, 365 nm y 380 nm de luz. La trayectoria de salida de la lámpara de arco contiene un espejo dicroico con una longitud de onda de corte de 409 nm que refleja la luz UV en un espejo que dirige la luz hacia un objetivo de microscopio de fluorescencia. La lente enfoca la luz de excitación en la muestra y recoge la luz emitida, que tiene una longitud de onda más larga de 510 nm. Esta luz emitida pasa a través del primer espejo dicroico, pero no por el segundo, ya que tiene una longitud de onda de corte de 552 nm. A continuación, una lente de campo enfoca la luz reflejada en el sensor del PMT. Mientras tanto, la fuente de iluminación (LED de 660 nm) para el microscopio de campo brillante se encuentra sobre la muestra. La luz transmitida se enfoca en la muestra mediante una lente de condensador, y el objetivo de fluorescencia de 20× captura la imagen de transmisión resultante. La longitud de onda utilizada para la iluminación de campo brillante excede la longitud de onda de corte de cada espejo dicroico, por lo que pasa a través de ambos antes de que la imagen se enfoque en el sensor de una cámara CMOS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Diseño del soporte de la cámara de medición. (A) Vista isométrica del soporte de la cámara de medición con trayectorias ópticas superpuestas. La iluminación de campo brillante se produce desde la superficie superior (ejez); La iluminación de fluorescencia se produce desde la superficie inferior (ejez),y la señal OCT del brazo de medición es ortogonal al otro eje de iluminación (ejey). Durante el experimento, dos ganchos de platino sostienen una trabécula dentro de un tubo capilar de vidrio que funciona como la cámara de medición. Los motores de bobina de voz controlan cada gancho y sus posiciones se miden mediante interferometría láser. La posición actual se compara con un punto de ajuste definido por el usuario y, utilizando un controlador PID codificado dentro de una FPGA, el error se minimiza. (B) Cámara de medición in situ con la iluminación de campo brillante encendida. La vista posterior se muestra en el recuadro de la Figura 1 . (C) Esquema del flujo de superfusado a través del soporte de la cámara de medición. El superfusado entra en la parte posterior del bloque y fluye en la dirección indicada por las flechas. Los electrodos aguas arriba y aguas abajo establecen la estimulación de campo para provocar la contracción de una trabécula montada en la cámara de medición. El sombreado azul indica las regiones donde fluye el superfusado durante un experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Panel frontal del software de adquisición y control de imágenes. ( A )Interfazde usuario de imágenes Brightfield. (B) Interfaz de usuario de imágenes OCT. (C) Interfaz de usuario de control de hardware. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Protocolo de disección y montaje de la trabécula. ( A )Corazónde rata perfundido por Langendorff en la cámara de disección. (B ) El mismo corazón con las aurículas eliminadas. Las líneas discontinuas indican la trayectoria de escisión para abrir los ventrículos. (C) Un corazón abierto para exponer el interior de ambos ventrículos. El cuadro discontinuo indica la región donde normalmente se encuentran las trabéculas. (D) Región de la pared ventricular derecha extirpada (la misma que indica el recuadro discontinuo en C). Las líneas discontinuas resaltan tres trabéculas. (E) Una trabécula seleccionada de las tres en D. (F) La trabécula del panel E con el tejido de la pared eliminado. (G) La trabécula aislada en el extremo de una jeringa de 1 ml. (H) La trabécula en la cámara de montaje. (I) La trabécula montada entre dos ganchos de platino. (J) La trabécula, montada entre ganchos, dentro de la cámara de medición (Figura 3B). La mancha verde es un artefacto del primer filtro dicroico. (K) Ángulo secundario de la trabécula montada dentro de la cámara de medición. La distancia entre la trabécula y la lente del objetivo del microscopio es de aproximadamente 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Dependencia de la posición de la medición de la fuerza. La fuerza producida por el músculo desde cada una de las posiciones de imagen(n = 7) superpuesta. La producción media de fuerza activa fue de 0,527 mN ± 0,003 mN, tiempo hasta el 50 % de contracción 77,1 ms ± 0,3 ms, y tiempo hasta el 50 % de relajación 328,1 ms ± 0,9 ms (todos los datos se presentan como la media ± SE). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: Análisis de imágenes OCT. (A) Ejemplo de segmentación WEKA. La sección transversal segmentada del músculo se resalta en rojo y el fondo se resalta en verde. (B) Vista superior de los datos brutos de C-scan de una trabécula. La línea en ángulo brillante hacia la parte superior de la imagen es el reflejo de la pared de la cámara de medición. (C) Vista lateral de los datos brutos de C-scan de una trabécula. (D) Vista superior de los datos segmentados de la PTU. (E) Vista lateral de los datos segmentados de los PTU. (F) El área de sección transversal a lo largo de la longitud de la trabécula ( ejex)a través del tiempo (eje y). El área transversal promedio a lo largo de la longitud muscular fue de 0.0326 mm2 ± 0.0005 mm2 (promedio ± S.E.) (G) Una malla de la trabécula. La malla se ha alineado aproximadamente con la gráfica de área de sección transversal del panel F. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 8: Análisis de imágenes de campo brillante y fluorescencia. (A) Imagen cosida (siete ventanas de imagen) de la trabécula. (B) Ca2+ transitorios a lo largo de la longitud de la trabécula. (C) Desplazamiento xpromedio de cada ventana de imagen. Un desplazamiento positivo representa un movimiento hacia la derecha y negativo hacia la izquierda. (D) Longitudes medias de sarcómeros de cada ventana de imagen que tenía el contraste de imagen necesario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Tabla 1: Tabla de soluciones Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discussion

En este estudio, presentamos una configuración que permite el ensamblaje de tres sistemas ópticos que combinan imágenes de campo brillante, fluorescencia y OCT para recopilar datos de una trabécula cardíaca ex vivo que se contrae activamente(Figura 1 y Figura 2). Tal integración orquestada es posible gracias al diseño de la cámara de medición (Figura 3) para permitir la disposición ortogonal de la OCT al eje de campo brillante-fluorescencia. El sistema de montaje muscular juega un papel igualmente importante en el éxito de las cuantificaciones simultáneas de los índices clave en la caracterización de la dinámica de excitación-contracción del músculo cardíaco. Su novedad reside en permitir procedimientos de escaneo muscular sin alteración aparente del rendimiento mecánico del músculo (Figura 6). Con la configuración combinada de imágenes y el sistema de gancho motorizado para la medición de la fuerza, este sistema puede evaluar la heterogeneidad regional en el transitorio Ca^2+, el desplazamiento y la longitud del sarcómero, junto con la información geométrica macroscópica de una trabécula en contracción a lo largo del curso temporal de la contracción(Figuras 7 y Figura 8).

Dada la ubicuidad de los sistemas de imágenes de epifluorescencia de campo brillante dentro de los laboratorios de investigación cardíaca, la reproducción de estos resultados se puede lograr con algunas consideraciones menores de hardware. Aquí, presentamos el kit de herramientas de procesamiento de imágenes para combinar la epifluorescencia de campo brillante y la OCT, que es esencial para analizar la heterogeneidad contráctil subyacente. La integración de la OCT requiere una ruta óptica sin obstrucciones, mientras que la imagen cerrada requiere una línea de disparo externa entre el estímulo y la OCT y la cámara de imágenes de campo brillante, y ganchos de montaje muscular que son capaces de mover la muestra a través de la cámara de medición. El software y los métodos de posprocesamiento requeridos están disponibles gratuitamente. En particular, el software de segmentación utilizado, WEKA^14,es de código abierto. La técnica de seguimiento sin marcadores de los puntos de material^8,la longitud del sarcómero, la imagen volumétrica cerrada¹⁰y los códigos de generación de malla también son accesibles y pueden estar disponibles a petición del autor correspondiente.

La viabilidad muscular, la carga óptima de Fura-2 y el enfoque de la imagen son los tres pilares que forman las bases de un experimento exitoso. El uso de una solución de disección que contiene BDM para prevenir la contractura, el transporte del músculo en una jeringa, la oxigenación continua de la solución y la preparación de nuevas soluciones experimentales el día de un experimento, contribuyen a una alta tasa de viabilidad muscular. Antes de cargar la trabécula con Fura-2AM, se debe recolectar autofluorescencia para cada condición que uno esté interesado en estudiar, ya que puede tener un efecto significativo en el Transitorio de Ca^{2+ medido 15.} La oxigenación de la solución de carga Fura-2AM se complica por la inclusión necesaria del surfactante pluronic-F127 para ayudar a la carga del tinte. Para combatir el exceso resultante de formación de burbujas causada por este surfactante, una pequeña gota de antiespumante en la solución de carga permite al usuario aumentar la tasa de oxigenación, mejorando así la posibilidad de que la trabécula mantenga la viabilidad funcional durante todo el proceso de carga. Finalmente, el enfoque de la imagen debe ser uniforme a lo largo de la longitud muscular para maximizar la relación señal-ruido de la información de campo brillante y fluorescencia.

Hay dos limitaciones a considerar con los métodos presentados aquí. Primero está la resolución espacial del microscopio de fluorescencia. Si bien las resoluciones espaciales de la OCT y las imágenes de campo brillante son altas, la resolución del microscopio de fluorescencia se limita a la integral de la fluorescencia del volumen capturado dentro de una ventana de imagen de 540 μm por 540 μm. Existe margen para aumentar la resolución espacial del microscopio de fluorescencia mediante el uso de una cámara de dispositivo de carga acoplada de alta ganancia, en lugar de un PMT, para capturar la señal de fluorescencia a expensas de la relación señal/ruido¹⁶. El segundo es el diámetro de la trabécula que se puede estudiar en términos de longitud medible del sarcómero y profundidad geométrica. El enfoque FFT en ventana para calcular la longitud del sarcómero explota el beneficio de una resolución espacial mejorada, pero se asocia con una robustez reducida(Figura 8D). En los casos en que se vayan a estudiar trabéculas turbias o de gran diámetro, la resolubilidad de la FFT se reducirá considerablemente debido al contraste reducido asociado con las bandas sarcoméricas en muestras de tejido más grandes. Del mismo modo, dentro de la OCT, las retro-reflexiones de una profundidad de imagen superior a 300 μm serán demasiado débiles para ser resueltas durante la etapa de segmentación. Por lo tanto, nuestra técnica se limita a trabéculas de un diámetro inferior a 300 μm. Sin embargo, no se recomienda estudiar muestras de gran diámetro ya que puede haber problemas con la oxigenación difusivo del núcleo muscular durante altas tasas de estimulación¹⁷.

Nuestro método permite la evaluación de la función mecánica iónica en asociación con la geometría muscular en músculos sanos y enfermos, proporcionando un enfoque poderoso para comprender la fisiología del músculo cardíaco, la fisiopatología y la farmacología. La canalización de procesamiento de imágenes descrita aquí extrae datos que serán fundamentales para obtener una comprensión más profunda de la heterogeneidad contráctil. Una vía para realizar plenamente el potencial de un conjunto de datos tan rico es en la construcción de modelos matemáticos que integren e interpreten estos datos, y para hacer predicciones que puedan probarse experimentalmente utilizando nuestro dispositivo.

Materials

2,3-Butanedione monoxime	Acros Organics	150375000
20× microscope lens	Nikon	CFI Super Fluor 20×	NA 0.75
2D Galvanometer	Thorlabs	GVSM002/M
50-50 beam splitter	Thorlabs	FC850-40-50-APC
90-10 beam-splitter	Thorlabs	TW850R2A2
Analogue input module	National Instruments	NI-9205	Records the PMT signal at 200 kHz
Brightfield imaging light source	CoolLED	PE-2	660 nm LAM
Broadband light source	Superlum	Broadlighter-840
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Cameralink card	National Instruments	NI-1429	Brightfield imaging frame grabber
Carbogen 5	BOC	Gas code: 181
Condensor lens	Nikon	LWD 0.52
D(+)-Glucose	Merck	108337
DAQ	National Instruments	NI-6259	Triggers the galvanometer movement
Dichroic mirror 1	Semrock	FF409-Di03
Dichroic mirror 2	Semrock	FF552-Di02
Diffraction grating	Wasatch Photonics	1200 lines/mm @840 nm
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	276855
Direct-Q 3 UV System	Merck Millipore	ZRQSVR3WW	Distilled water machine
Dry bath	Corning	6875-SB	LSE digital dry bath
FIJI	ImageJ		Open-source image processing software
Fura-2AM pentapotassium salt	Thermofisher	F14186
Hardware FPGA card	National Instruments	NI-7813R	Also controls the triggering of the brightfield capture
Heparin	Pfizer	61024
HEPES	PanReac AppliChem	A1069
Inverted microscope	Nikon	TI-DH illumination pillar
Isofluorane	MedSource	VAPDRUGISO250
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Line-scan camera	Basler	spL2048-70km	Spectrometer camera
Magnetic stirrer	IKA	3810000	RCT basic
Matlab	Mathworks		Data processing code
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	M1880
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
NaH2PO4.2H2O	Sigma-Aldrich	71505
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
OCT FPGA card	National Instruments	NI-1483R
Oxygen tank	BOC	Gas code: 100D
pH meter	Mettler Toledo	MP220
Photomultiplier tube	Hamamatsu	H7422-20
Powerload	Thermofisher	P10020
Superluminescent diode	Broadlighter	D-840
Transimpedance amplifier	Custom
Tris(hydroxymethyl)amino-methane	Sigma-Aldrich	252859
Wistar rat	Vernon Jansen Unit		8 – 10 weeks
Xenon arc lamp	Sutter Instrument	DG-4	Lambda DG-4