광유전학 적 TAEL/C120 시스템을 사용하여 제브라피시 배아에서 빛 유발 GFP 발현
Summary
광유전학은 광범위한 응용 프로그램을 가진 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 청색 광 반응 TAEL/C120 시스템을 사용하여 제브라피시 배아에서 빛을 유도할 수 없는 유전자 발현을 달성하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
유도 성 유전자 발현 시스템은 생물학적 과정을 연구하기위한 귀중한 도구입니다. 광유전학 적 발현 시스템은 유도제로 빛을 사용하여 유전자 발현 타이밍, 위치 및 진폭에 대한 정밀한 제어를 제공 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 광유전학 발현 시스템은 제브라피시 배아에서 빛을 유도할 수 없는 유전자 발현을 달성하기 위하여 이용됩니다. 이 시스템은 박테리아 E. litoralis에서자연적으로 발생하는 빛 활성화 전사 인자를 기반으로 TAEL이라는 엔지니어링 전사 인자에 의존한다. 파란색 광으로 조명되면 TAEL은 C120이라는 코그네이트 규제 요소에 팽창하고 전사를 활성화합니다. 이 프로토콜은 유비쿼터스 유브 프로모터의 통제 하에 TAEL 전사 인자를 표현하는 형질전환 제브라피시 배아를 사용합니다. 동시에, C120 조절 원소는 형광 기자 유전자(GFP)의 발현을 구동한다. 간단한 LED 패널을 사용하여 활성화된 청색광을 전달하며, GFP 발현의 유도는 30분 후에 먼저 검출될 수 있으며 3시간 이상의 광처리 후 130배 이상의 유도에 도달할 수 있다. 발현 유도는 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) 및 형광 현미경 검사법에 의해 평가될 수 있다. 이 방법은 광유전학 유전자 발현을 위한 다재다능하고 사용하기 쉬운 접근법입니다.
Introduction
유도 성 유전자 발현 시스템은 유전자 발현의 양, 타이밍 및 위치를 제어하는 데 도움이됩니다. 그러나, 다세포 유기체에 있는 정확한 공간 및 측두색 통제를 달성하는 것은 도전적이고 있습니다. 측두성 조절은 가장 일반적으로 소분자 화합물 을 첨가하여 달성1 또는 열 충격 프로모터2의 활성화. 여전히 두 가지 접근 방식은 타이밍, 유도 강도 및 오프 타겟 스트레스 응답 문제에 취약합니다. 공간 제어는 주로 조직 별 발기인3의사용에 의해 달성되지만,이 방법은 항상 사용할 수없는 적합한 프로모터 또는 규제 요소를 필요로하며, 하위 조직 수준 유도에 도움이되지 않습니다.
이러한 종래의 접근법과는 달리, 빛 활성화된 광유전적 전사 활성제는 유전자 발현4의더 미세한 공간 및 측두각 제어를 위한 잠재력을 갖는다. 파란색 광 반응형 TAEL/C120 시스템은 제브라피시 배아5,6에서사용하도록 개발및 최적화되었다. 본 시스템은 박테리아 E. 리토랄리스7,8로부터내인성 빛 활성화 전사 인자를 기반으로 한다. TAEL/C120 시스템은 Kal-TA4 트랜스활성화 도메인, 청색 광 반응형 LOV(광산소전압 감지) 도메인, 나선 턴-나선(HTH) DNA 결합 도메인5를포함하는 TAEL이라는 전사 활성제로 구성된다. 조명시, LOV 도메인은 두 개의 TAEL 분자가 분담하고, TAEL 반응형 C120 프로모터에 결합하고, 관심 있는 다운스트림 유전자의 전사를 개시하는 것을 허용하는 형태 변화를 겪습니다5,8. TAEL/C120 시스템은 독성을 최소화하여 신속하고 견고한 유도를 나타내며, 여러 가지 다른 광 전달 양식에 의해 활성화될 수 있습니다. 최근에는 TAEL/C120 시스템의 개선은 TAEL(TAEL-N)에 핵국소화 신호를 추가하고 C120 조절 요소를 cFos 기저 프로모터(C120F)(도1A)에결합하여 이루어졌다. 이러한 수정은 유도 수준을 15배 이상6배이상 향상시킴으로써.
이 프로토콜에서, 간단한 LED 패널은 TAEL/C120 시스템을 활성화하고 기자 유전자, GFP의 유비쿼터스 발현을 유도하는 데 사용된다. 발현 유도는 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)을 사용하여 성적증명서 수준을 측정하여 형광 강도를 관찰하거나 정량적으로 관찰함으로써 질적으로 모니터링될 수 있다. 이 프로토콜은 TAEL/C120 시스템을 생체 내에서유전자 발현의 강력한 조절을 가능하게 하는 다재다능하고 사용하기 쉬운 도구로 시연할 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 청색 광 유도성 유전자 발현을 달성하기 위하여 광유전학 TAEL/C120 시스템의 사용을 기술합니다. 이 시스템은 발광시 블루라이트로 이산화하고 C120 조절 요소의 하류에 대한 관심 유전자의 전사를 활성화하는 전사 활성제 인 TAEL로 구성됩니다. GFP 리포터의 유도된 발현은 30분 에 불과한 빛 노출 후에 검출될 수 있으며, 이는 이 접근법이 상대적으로 빠르고 반응성이 뛰어난 운동학을 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 스테판 Materna와 이 프로토콜에 대한 유용한 제안과 의견에 대한 우와 마테나 연구소의 구성원에게 감사드립니다. 이 프로토콜을 개발하면서 안나 리드, 케빈 가드너, 로라 모타 메나에게 귀중한 토론과 통찰력을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 국립 보건원 (NIH)의 보조금에 의해 지원되었다; R03 DK106358) 및 캘리포니아 대학 암 연구 조정 위원회 (CRN-20-636896) S.W.
Materials
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instsant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
References
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