用于荧光标记大促卵体定量的自动成像和分析

Summary

使用多孔微孔板的自动测定是识别通路调节剂的有利方法，因为它允许在单个实验中评估多种条件。在这里，我们将完善的巨噬菌体成像和定量方案改编为96孔微孔板格式，并为使用多模读板仪的自动化提供了全面的概述。

Abstract

大吞细胞增多症是一种非特异性液相摄取途径，允许细胞通过大量内吞作用内吞化大细胞外货物，如蛋白质、病原体和细胞碎片。该途径在各种细胞过程中起着至关重要的作用，包括免疫反应和癌细胞代谢的调节。鉴于这种在生物学功能中的重要性，检查细胞培养条件可以通过识别该途径的调节因子并优化用于发现新治疗方法的条件来提供有价值的信息。该研究描述了一种使用标准实验室设备和细胞成像多模读板仪的自动成像和分析技术，用于快速定量贴壁细胞中的大旋囊细胞指数。该自动化方法基于高分子量荧光葡聚糖的摄取，可应用于96孔微孔板，以方便评估一个实验中的多种条件或安装在玻璃盖玻片上的固定样品。这种方法旨在最大限度地提高可重复性并减少实验变异，同时节省时间和成本效益。

Introduction

巨噬细胞增多症的非特异性内吞途径允许细胞通过大量摄取细胞外液及其成分来内化各种细胞外成分，包括营养素、蛋白质、抗原和病原体¹。虽然对许多细胞类型的生物学很重要，但越来越多地描述了巨细胞增多途径在肿瘤生物学中起着至关重要的作用，其中通过大囊泡摄取，肿瘤细胞能够在营养耗尽的微环境中存活和增殖^2，3。细胞外大分子（包括白蛋白和细胞外基质）以及坏死细胞碎片的摄取，通过大卵子体和溶酶体融合介导的货物分解代谢产生氨基酸、糖、脂质和核苷酸，为生物质生产提供了替代营养来源^{4，5，6，7，8}。

巨噬细胞增多症的诱导和调节是复杂的，并且可能因细胞环境而异。到目前为止，已经确定了几种大吞细胞增多症的诱导剂，包括配体，例如表皮生长因子（EGF），血小板衍生生长因子（PDGF），半乳糖凝集素-3和Wnt3A9，^{10，11，12，13}。此外，模拟肿瘤微环境的培养条件可以触发该途径的激活。胰腺导管腺癌（PDAC）肿瘤营养不足，特别是对于氨基酸谷氨酰胺，它导致癌细胞和癌症相关成纤维细胞（CAFs）依赖巨噬细胞增多症生存^{7，13，14，15}。此外，缺氧和氧化应激等肿瘤应激可以激活这种清除途径¹⁶。除了可以诱导巨噬细胞增多症的众多外在影响因素外，多种细胞内途径控制着巨噬细胞体的形成。致癌性Ras介导的转化足以启动大棘球机制，多种癌症类型表现出致癌Ras驱动的组成性巨噬细胞增多症^{4，5，9，17}。或者，已经鉴定出野生型Ras激活和Ras非依赖性途径可以激活癌细胞和CAFs中的巨肺细胞增多^{症10，11，15，18}。使用各种体外模型与抑制剂治疗相结合，已经鉴定出几种巨噬细胞增多调节剂，包括钠氢交换剂，小GTP酶Rac1，磷酸肌醇3-激酶（PI3K），p21活化激酶（Pak）和AMP活化蛋白激酶（AMPK）^4，13，15.然而，鉴于调节巨噬细胞增多症的众多所述因素和条件，可以想象更多的调节剂和刺激仍未被发现。通过在单个实验中自动评估多种条件，可以促进新型调节剂和刺激的鉴定。这种方法可以阐明参与大卵子体形成的因素，并可能允许发现靶向该途径的新型小分子或生物制剂。

在这里，我们将先前建立的用于在体外测定癌细胞中巨噬细胞中巨噬细胞作用程度的方案调整为96孔微孔板格式以及自动成像和定量^19，20。该协议基于荧光显微镜，已成为在体外和体内确定巨肺细胞增多症领域的标准^4，5，⁶，^7，9，^{10，11，12，13，15，16，17，18，19，20，21，22}。大卵磷脂体可以通过其内化大分子的能力与其他内吞途径区分开来，例如高分子量葡聚糖（即70 kDa）2^，3，^{4，20，21，22，23}。因此，可以通过摄取细胞外施用的荧光团标记的70 kDa葡聚糖来定义大卵子体。结果，大脊髓细胞囊泡表现为细胞内荧光点簇，大小范围为0.2-5μm。这些点可以进行显微镜成像并随后进行定量，以确定细胞中巨肺细胞增多的程度 – “大棘球细胞指数”。

在该协议中，描述了使用标准实验室设备在96孔微孔板和盖玻片上 体外 可视化贴壁细胞中巨卵子体的基本步骤 （图1）。此外，还提供了使用细胞成像多模读板仪自动获取图像和定量大旋心核细胞指数的方向。与我们之前描述的协议相比，这种自动化减少了时间、成本和工作量^19，20。此外，它避免了无意中偏倚的成像采集和分析，从而提高了再现性和可靠性。该方法可以很容易地适应不同的细胞类型或读板器，或者用于确定替代的大促卵子体特征，如大小，数量和位置。本文描述的方法特别适用于筛选诱导巨噬细胞增多症的细胞培养条件，鉴定新型调节剂，或优化已知抑制剂的药物浓度。

图1：用于确定贴壁细胞中”大脊髓细胞指数”的自动测定示意图。 使用BioRender创建。 请点击此处查看此图的放大版本。

Protocol

1. 准备材料 将标有FITC或四甲基罗丹明（TMR）的70 kDa葡聚糖溶解在PBS中，以获得20mg / mL溶液。将等分试样储存在-20°C。 将DAPI溶解在ddH 2 O中，以获得1mg / mL溶液。将等分试样储存在-20°C。注意：DAPI 是一种潜在的致癌物质，应谨慎处理。 在固定当天，在PBS中制备新鲜的3.7S级甲醛。注意：甲醛是一种固定剂，已知致癌物质，吸入有毒。在化学通风橱中制作溶液?…

Representative Results

当相应地遵循上述方案的步骤和调整时，最终实验结果应提供有关所研究的细胞培养条件或抑制剂是否诱导或减少目标细胞系中的巨噬细胞增多症的信息。为了加强这些发现的有效性，纳入控制条件将允许对结果进行仔细检查，以确定实验是否已成功完成。巨噬细胞增多症诱导对照将提供有关巨噬细胞增多症相对水平的信息。为此，配体EGF是最常用的13。在AsPC-1 PDAC细胞中，在加…

Discussion

实验和数据采集的质量在很大程度上取决于试剂的质量、设置的优化以及盖玻片和微孔板的清洁度。最终结果应给出重复之间的最小差异;然而，生物变异确实是自然发生的，或者可能是由许多因素引起的。细胞密度可能导致细胞或多或少地对巨噬细胞增多诱导剂或抑制剂作出反应。因此，遵守协议中建议的80%汇合度至关重要。或者，微孔板制造商有充分的记录，即介质蒸发发生在96孔微孔板上。?…

Materials

0.25% Trypsin	Corning	25053CI	0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate
1.5 mL Microcentrifuge tube	Fisherbrand	05-408-129
10-cm Tissue culture dish	Greiner Bio-One	664160	CELLSTAR
15 mL Centrifuge tube	Fisherbrand	07-200-886
2 L Beaker	Fisherbrand	02-591-33
24-well Tissue culture plate	Greiner Bio-One	662160	CELLSTAR
25 mL Reagent reservoir	Genesee Scientific Corporation	28-121
500 mL Beaker	Fisherbrand	02-591-30
6-cm Tissue culture dish	Greiner Bio-One	628160	CELLSTAR
8-Channel aspiration adapter	Integra Biosciences	155503
8-Channel aspiration adapter for standard tips	Integra Biosciences	159024
95% Ethanol	Decon Laboratories Inc	4355226
Ammonia-free glass cleaner	Sparkle	FUN20500CT
Black 96-well high-content screening microplate	PerkinElmer	6055300	CellCarrier-96 Ultra
Cotton-tipped applicator	Fisherbrand	23-400-101
Coverslips	Fisherbrand	12-545-80	12 mm diameter
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader	Biotek	CYT5FW
DAPI	Millipore Sigma	5.08741
Dextran 70 kDa – FITC	Life Technologies	D1822	Lysine-fixable
Dextran 70 kDa – TMR	Life Technologies	D1819
DMSO	Millipore Sigma	D1435
DPBS	Corning	21031CV	Without Calcium and Magnesium
Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dumont #5
Formaldehyde, 37%	Ricca Chemical	RSOF0010-250A	ACS Reagent Grade
Glycerol	Fisher BioReagents	BP229-1
Hardening fluorescence mounting media	Agilent Tech	S302380-2	DAKO
Hoechst 33342	Millipore Sigma	B2261
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher Chemical	A144-212	Certified ACS Plus, 36.5%–38.0%
Lint-free wipes	Kimberly-Clark	34155	Kimwipes
Miscroscope slides	Fisherbrand	12-544-1	Premium plain glass
Multichannel pipette	Gilson	FA10013	8 channels, 0.5–10 µL
Multichannel pipette	Gilson	FA10012	12 channels, 20–200 µL
Multichannel pipette	Gilson	FA10011	8 channels, 20–200 µL
Parafilm M	Pechiney	PM996
Plastic wrap	Kirkland Signature	208733	Stretch-Tite
Silicone isolators	Grace Bio Labs Inc	664107	13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm
Slide adapter	Biotek	1220548
Wash bottle	Fisherbrand	FB0340922C