Automatiseret billeddannelse og analyse til kvantificering af fluorescerende mærkede makropinosomer

Summary

Automatiserede assays ved hjælp af mikroplader med flere brønde er fordelagtige tilgange til identifikation af vejregulatorer ved at muliggøre vurdering af en lang række betingelser i et enkelt eksperiment. Her har vi tilpasset den veletablerede makropinosombilleddannelses- og kvantificeringsprotokol til et 96-brønds mikropladeformat og giver en omfattende oversigt over automatisering ved hjælp af en multi-mode pladelæser.

Abstract

Makropinocytose er en ikke-specifik væskefaseoptagelsesvej, der gør det muligt for celler at internalisere stor ekstracellulær last, såsom proteiner, patogener og celleaffald, gennem bulkendocytose. Denne vej spiller en væsentlig rolle i en række cellulære processer, herunder regulering af immunresponser og kræftcellemetabolisme. I betragtning af denne betydning i biologisk funktion kan undersøgelse af cellekulturbetingelser give værdifuld information ved at identificere regulatorer af denne vej og optimere betingelser, der skal anvendes i opdagelsen af nye terapeutiske tilgange. Undersøgelsen beskriver en automatiseret billeddannelses- og analyseteknik ved hjælp af standard laboratorieudstyr og en cellebilleddannelse multi-mode pladelæser til hurtig kvantificering af det makropinocytiske indeks i klæbende celler. Den automatiserede metode er baseret på optagelse af fluorescerende dextran med høj molekylvægt og kan anvendes på mikroplader med 96 brønde for at lette vurderinger af flere forhold i et eksperiment eller faste prøver monteret på glasdæksler. Denne tilgang sigter mod at maksimere reproducerbarheden og reducere eksperimentel variation, samtidig med at den er både tidsbesparende og omkostningseffektiv.

Introduction

Den ikke-specifikke endocytiske vej for makropinocytose gør det muligt for celler at internalisere en række ekstracellulære komponenter, herunder næringsstoffer, proteiner, antigener og patogener, gennem bulkoptagelse af ekstracellulær væske og dets ^bestanddele1. Selvom det er vigtigt for biologien hos mange celletyper, beskrives makropinocytosevejen i stigende grad at spille en væsentlig rolle i tumorbiologi, hvor tumorceller gennem makropinocytisk optagelse er i stand til at overleve og sprede sig i nærvær af et næringsstofudtømt ^{mikromiljø2,3}. Optagelsen af ekstracellulære makromolekyler, herunder albumin og ekstracellulær matrix og nekrotisk celleaffald, giver en alternativ næringskilde til biomasseproduktion ved at skabe aminosyrer, sukkerarter, lipider og nukleotider gennem makropinosom og lysosomfusionsmedieret lastkatabolisme4,5,6,7,8.

Induktion og regulering af makropinocytose er kompleks og kan variere afhængigt af cellulær kontekst. Indtil videre er flere inducere af makropinocytose blevet identificeret og omfatter ligander, såsom epidermal vækstfaktor (EGF), blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF), galectin-3 og Wnt3A9,10,11,12,13. Derudover kan dyrkningsbetingelser, der efterligner tumormikromiljøet, udløse aktivering af vejen. Pankreas duktal adenocarcinom (PDAC) tumorer er næringsstofberøvet, især for aminosyren glutamin, hvilket får både kræftceller og kræftassocierede fibroblaster (CAF’er) til at stole på makropinocytose for overlevelse7,13,14,15. Desuden kan tumorspændinger, såsom hypoxi og oxidativ stress, aktivere denne ådselsvej16. Ud over de mange ydre påvirkere, der kan inducere makropinocytose, styrer en række intracellulære veje makropinosomdannelse. Onkogen Ras-medieret transformation er tilstrækkelig til at starte det makropinocytiske maskineri, og flere kræfttyper udviser onkogen Ras-drevet konstitutiv makropinocytose4,5,9,17. Alternativt er vildtype Ras-aktivering og Ras-uafhængige veje blevet identificeret for at aktivere makropinocytose i kræftceller og CAF’er10,11,15,18. Anvendelsen af forskellige in vitro-modeller i kombination med inhibitorbehandlinger har resulteret i identifikation af flere makropinocytosemodulatorer, som omfatter natrium-hydrogenbyttere, den lille GTPase Rac1, phosphoinositid 3-kinase (PI3K), p21-aktiveret kinase (Pak) og AMP-aktiveret proteinkinase (AMPK)^4,13,15 . I betragtning af de mange beskrevne faktorer og tilstande, der regulerer makropinocytose, er det imidlertid tænkeligt, at mange flere modulatorer og stimuli forbliver uopdagede. Identifikationen af nye modulatorer og stimuli kan lettes ved automatiseret vurdering af en lang række forhold i et enkelt eksperiment. Denne metode kan kaste lys over de faktorer, der er involveret i makropinosomdannelse og kan muliggøre opdagelsen af nye små molekyler eller biologiske lægemidler, der er målrettet mod denne vej.

Her har vi tilpasset vores tidligere etablerede protokol til bestemmelse af omfanget af makropinocytose i kræftceller in vitro til et 96-brønds mikropladeformat og automatiseret billeddannelse og kvantificering19,20. Denne protokol er baseret på fluorescerende mikroskopi, som er blevet en standard på området til bestemmelse af makropinocytose in vitro og in vivo4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18^, 19,20,21,22. Makropinosomer kan skelnes fra andre endocytiske veje gennem deres evne til at internalisere store makromolekyler, såsom højmolekylær dextran (dvs. 70 kDa)2,3,4,20,21,22,23. Således kan makropinosomer defineres ved optagelse af ekstracellulært administreret fluorofor-mærket 70 kDa dextran. Som et resultat manifesterer makropinocytiske vesikler sig som intracellulære klynger af fluorescerende puncta med størrelser fra 0,2-5 μm. Disse puncta kan mikroskopisk afbildes og efterfølgende kvantificeres for at bestemme omfanget af makropinocytose i cellen – ‘det makropinocytiske indeks’.

I denne protokol beskrives de væsentlige trin til visualisering af makropinosomer i klæbende celler in vitro på en 96-brønds mikroplade og dæksedler ved hjælp af standard laboratorieudstyr (figur 1). Derudover gives anvisningerne til automatisering af billedindsamling og kvantificering af det makropinocytiske indeks ved hjælp af en cellebilleddannelsespladelæser med flere tilstande. Denne automatisering reducerer tid, omkostninger og kræfter sammenlignet med vores tidligere beskrevne ^{protokoller19,20}. Derudover undgår det utilsigtet forudindtaget billedindsamling og analyse og forbedrer derved reproducerbarheden og pålideligheden. Denne metode kan let tilpasses forskellige celletyper eller pladelæsere eller bruges til at bestemme alternative makropinosomfunktioner, såsom størrelse, antal og placering. Den heri beskrevne metode er især velegnet til screening af cellekulturbetingelser, der inducerer makropinocytose, identifikation af nye modulatorer eller optimering af lægemiddelkoncentrationer af kendte hæmmere.

Figur 1: Skematisk over det automatiserede assay til bestemmelse af det ‘makropinocytiske indeks’ i klæbende celler. Oprettet ved hjælp af BioRender. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

1. Forberedelse af materialer 70 kDa dextran mærket med FITC eller tetramethylrhodamin (TMR) opløses i PBS for at opnå en 20 mg/ml opløsning. Aliquoterne opbevares ved -20 °C. DAPI opløses i ddH2O for at opnå en 1 mg/ml opløsning. Aliquoterne opbevares ved -20 °C.FORSIGTIG: DAPI er et potentielt kræftfremkaldende stof og bør håndteres med forsigtighed. På fikseringsdagen skal du forberede frisk 3,7% ACS-formaldehyd i PBS.FORSIGTIG: Formaldehyd er et fikserings…

Representative Results

Når trinnene og justeringen af den ovenfor beskrevne protokol følges i overensstemmelse hermed, bør de endelige eksperimentelle resultater give oplysninger om, hvorvidt de undersøgte cellekulturbetingelser eller hæmmere inducerer eller reducerer makropinocytose i cellelinjen af interesse. For at styrke gyldigheden af disse resultater vil inddragelsen af kontrolbetingelser gøre det muligt at undersøge resultaterne for at afgøre, om eksperimentet er afsluttet med succes. Makropinocytoseinduktionskontroller vil give…

Discussion

Kvaliteten af eksperimenterne og dataindsamlingen afhænger i høj grad af reagensernes kvalitet, optimeringen af indstillingerne og renheden af dæksedlerne og mikropladen. De endelige resultater bør give minimal variation mellem replikater; biologiske variationer forekommer dog naturligt eller kan på anden måde skyldes en række faktorer. Celletæthed kan få celler til at reagere mere eller mindre på makropinocytoseinducere eller hæmmere. Det er derfor afgørende at overholde 80% sammenløbet som foreslået her i…

Materials

0.25% Trypsin	Corning	25053CI	0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate
1.5 mL Microcentrifuge tube	Fisherbrand	05-408-129
10-cm Tissue culture dish	Greiner Bio-One	664160	CELLSTAR
15 mL Centrifuge tube	Fisherbrand	07-200-886
2 L Beaker	Fisherbrand	02-591-33
24-well Tissue culture plate	Greiner Bio-One	662160	CELLSTAR
25 mL Reagent reservoir	Genesee Scientific Corporation	28-121
500 mL Beaker	Fisherbrand	02-591-30
6-cm Tissue culture dish	Greiner Bio-One	628160	CELLSTAR
8-Channel aspiration adapter	Integra Biosciences	155503
8-Channel aspiration adapter for standard tips	Integra Biosciences	159024
95% Ethanol	Decon Laboratories Inc	4355226
Ammonia-free glass cleaner	Sparkle	FUN20500CT
Black 96-well high-content screening microplate	PerkinElmer	6055300	CellCarrier-96 Ultra
Cotton-tipped applicator	Fisherbrand	23-400-101
Coverslips	Fisherbrand	12-545-80	12 mm diameter
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader	Biotek	CYT5FW
DAPI	Millipore Sigma	5.08741
Dextran 70 kDa – FITC	Life Technologies	D1822	Lysine-fixable
Dextran 70 kDa – TMR	Life Technologies	D1819
DMSO	Millipore Sigma	D1435
DPBS	Corning	21031CV	Without Calcium and Magnesium
Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dumont #5
Formaldehyde, 37%	Ricca Chemical	RSOF0010-250A	ACS Reagent Grade
Glycerol	Fisher BioReagents	BP229-1
Hardening fluorescence mounting media	Agilent Tech	S302380-2	DAKO
Hoechst 33342	Millipore Sigma	B2261
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher Chemical	A144-212	Certified ACS Plus, 36.5%–38.0%
Lint-free wipes	Kimberly-Clark	34155	Kimwipes
Miscroscope slides	Fisherbrand	12-544-1	Premium plain glass
Multichannel pipette	Gilson	FA10013	8 channels, 0.5–10 µL
Multichannel pipette	Gilson	FA10012	12 channels, 20–200 µL
Multichannel pipette	Gilson	FA10011	8 channels, 20–200 µL
Parafilm M	Pechiney	PM996
Plastic wrap	Kirkland Signature	208733	Stretch-Tite
Silicone isolators	Grace Bio Labs Inc	664107	13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm
Slide adapter	Biotek	1220548
Wash bottle	Fisherbrand	FB0340922C