Imaging e analisi automatizzati per la quantificazione di macropinosomi marcati fluorescentemente

Summary

I saggi automatizzati che utilizzano micropiastre multi-pozzo sono approcci vantaggiosi per identificare i regolatori di percorso consentendo la valutazione di una moltitudine di condizioni in un singolo esperimento. Qui, abbiamo adattato il consolidato protocollo di imaging e quantificazione dei macropinosomi a un formato di micropiastre a 96 pozzetti e forniamo uno schema completo per l’automazione utilizzando un lettore di piastre multimodale.

Abstract

La macropinocitosi è una via di assorbimento in fase fluida non specifica che consente alle cellule di internalizzare grandi carichi extracellulari, come proteine, agenti patogeni e detriti cellulari, attraverso l’endocitosi di massa. Questo percorso svolge un ruolo essenziale in una varietà di processi cellulari, tra cui la regolazione delle risposte immunitarie e il metabolismo delle cellule tumorali. Data questa importanza nella funzione biologica, l’esame delle condizioni di coltura cellulare può fornire informazioni preziose identificando i regolatori di questo percorso e ottimizzando le condizioni da impiegare nella scoperta di nuovi approcci terapeutici. Lo studio descrive una tecnica automatizzata di imaging e analisi che utilizza apparecchiature di laboratorio standard e un lettore di piastre multimodale per l’imaging cellulare per la rapida quantificazione dell’indice macropinocitico nelle cellule aderenti. Il metodo automatizzato si basa sull’assorbimento di destrano fluorescente ad alto peso molecolare e può essere applicato a micropiastre a 96 pozzetti per facilitare la valutazione di più condizioni in un esperimento o campioni fissi montati su coperture di vetro. Questo approccio mira a massimizzare la riproducibilità e ridurre la variazione sperimentale, risparmiando tempo ed economicamente vantaggioso.

Introduction

La via endocitica non specifica della macropinocitosi consente alle cellule di interiorizzare una varietà di componenti extracellulari, tra cui nutrienti, proteine, antigeni e agenti patogeni, attraverso l’assorbimento di massa del fluido extracellulare e dei suoi ^costituenti1. Sebbene importante per la biologia di numerosi tipi cellulari, sempre più spesso, la via della macropinocitosi è descritta per svolgere un ruolo essenziale nella biologia tumorale, dove, attraverso l’assorbimento macropinocitico, le cellule tumorali sono in grado di sopravvivere e proliferare in presenza di un microambiente impoverito di ^nutrienti2,3. L’assorbimento di macromolecole extracellulari, tra cui albumina e matrice extracellulare, e detriti cellulari necrotici, fornisce una fonte alternativa di nutrienti per la produzione di biomassa creando aminoacidi, zuccheri, lipidi e nucleotidi attraverso il catabolismo cargo mediato da macropinosomi e lisosomi4,5,6,7,8.

L’induzione e la regolazione della macropinocitosi sono complesse e possono variare a seconda del contesto cellulare. Finora, sono stati identificati diversi induttori della macropinocitosi e includono ligandi, come il fattore di crescita epidermico (EGF), il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF), la galectina-3 e Wnt3A9,10,11,12,13. Inoltre, le condizioni di coltura che imitano il microambiente tumorale possono innescare l’attivazione del percorso. I tumori dell’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) sono privi di nutrienti, in particolare per l’aminoacido glutammina, che fa sì che sia le cellule tumorali che i fibroblasti associati al cancro (CAS) si affidino alla macropinocitosi per la sopravvivenza7,13,14,15. Inoltre, gli stress tumorali, come l’ipossia e lo stress ossidativo, possono attivare questa via di scavenging16. Oltre ai numerosi influenzatori estrinseci che possono indurre macropinocitosi, una varietà di percorsi intracellulari controlla la formazione di macropinosomi. La trasformazione oncogenica mediata da Ras è sufficiente per avviare il meccanismo macropinocitico e più tipi di cancro presentano macropinocitosi costitutiva oncogenica guidata da Ras4,5,9,17. In alternativa, sono state identificate l’attivazione di Ras wild-type e le vie Ras-indipendenti per attivare la macropinocitosi nelle cellule tumorali e nelle ^{CAF10,11,15,18}. L’uso di vari modelli in vitro in combinazione con trattamenti inibitori ha portato all’identificazione di diversi modulatori della macropinocitosi, che includono scambiatori di sodio-idrogeno, la piccola GTPasi Rac1, fosfoinositide 3-chinasi (PI3K), chinasi attivata da p21 (Pak) e proteina chinasi attivata da AMP (AMPK)^4,13,15 . Tuttavia, data la moltitudine di fattori e condizioni descritti che regolano la macropinocitosi, è concepibile che molti più modulatori e stimoli rimangano sconosciuti. L’identificazione di nuovi modulatori e stimoli può essere facilitata dalla valutazione automatizzata di una moltitudine di condizioni in un singolo esperimento. Questa metodologia può far luce sui fattori coinvolti nella formazione dei macropinosomi e può consentire la scoperta di nuove piccole molecole o biologici che mirano a questo percorso.

Qui, abbiamo adattato il nostro protocollo precedentemente stabilito per determinare l’estensione della macropinocitosi nelle cellule tumorali in vitro a un formato di micropiastre a 96 pozzetti e l’imaging e la quantificazione ^{automatizzati19,20}. Questo protocollo si basa sulla microscopia fluorescente, che è diventata uno standard nel campo per determinare la macropinocitosi in vitro e de vivo4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18^, 19,20,21,22. I macropinosomi possono essere distinti da altre vie endocitiche attraverso la loro capacità di internalizzare macromolecole di grandi dimensioni, come il destrano ad alto peso molecolare (cioè 70 kDa)2,3,4,20,21,22,23. Pertanto, i macropinosomi possono essere definiti attraverso l’assorbimento di 70 kDa destrano 70 kDa somministrato extracellulare. Di conseguenza, le vescicole macropinocitiche si manifestano come cluster intracellulari di puncta fluorescenti con dimensioni comprese tra 0,2 e 5 μm. Questi puncta possono essere ripresi al microscopio e successivamente quantificati per determinare l’estensione della macropinocitosi nella cellula – “l’indice macropinocitico”.

In questo protocollo, vengono descritti i passaggi essenziali per visualizzare i macropinosomi nelle cellule aderenti in vitro su una micropiastra a 96 pozzetti e coverslip utilizzando apparecchiature di laboratorio standard (Figura 1). Inoltre, vengono fornite le indicazioni per automatizzare l’acquisizione dell’immagine e la quantificazione dell’indice macropinocitico utilizzando un lettore di lastre multimodale di imaging cellulare. Questa automazione riduce tempi, costi e sforzi rispetto ai nostri protocolli descritti in ^{precedenza19,20}. Inoltre, evita l’acquisizione e l’analisi di immagini involontariamente distorte e quindi migliora la riproducibilità e l’affidabilità. Questo metodo può essere facilmente adattato a diversi tipi di celle o lettori di piastre o essere utilizzato per determinare caratteristiche macropinosomiche alternative, come dimensioni, numero e posizione. Il metodo qui descritto è particolarmente adatto per lo screening di condizioni di coltura cellulare che inducono macropinocitosi, l’identificazione di nuovi modulatori o l’ottimizzazione delle concentrazioni di farmaci di inibitori noti.

Figura 1: Schema del test automatizzato per determinare l'”indice macropinocitico” nelle cellule aderenti. Creato utilizzando BioRender. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. Preparazione dei materiali Sciogliere 70 kDa destrano marcato con FITC o tetrametilrodramina (TMR) in PBS per ottenere una soluzione da 20 mg/mL. Conservare le aliquote a -20 °C. Sciogliere DAPI in ddH2O per ottenere una soluzione da 1 mg/mL. Conservare le aliquote a -20 °C.ATTENZIONE: DAPI è un potenziale cancerogeno e deve essere maneggiato con cura. Il giorno della fissazione, preparare formaldeide fresca al 3,7% di grado ACS in PBS.ATTENZIONE: La formaldeide è u…

Representative Results

Quando i passaggi e l’aggiustamento del protocollo sopra descritto vengono seguiti di conseguenza, i risultati sperimentali finali dovrebbero fornire informazioni sul fatto che le condizioni di coltura cellulare studiate o gli inibitori inducano o riducano la macropinocitosi nella linea cellulare di interesse. Per rafforzare la validità di questi risultati, l’inclusione di condizioni di controllo consentirà l’esame dei risultati per determinare se l’esperimento è stato completato con successo. I controlli di induzione…

Discussion

La qualità degli esperimenti e dell’acquisizione dei dati dipende molto dalla qualità dei reagenti, dall’ottimizzazione delle impostazioni e dalla pulizia delle coperture e delle micropiastre. I risultati finali dovrebbero dare una variazione minima tra le repliche; tuttavia, le variazioni biologiche si verificano naturalmente o possono essere altrimenti causate da una serie di fattori. La densità cellulare può indurre le cellule a rispondere più o meno agli induttori o agli inibitori della macropinocitosi. E’ quind…

Materials

0.25% Trypsin	Corning	25053CI	0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate
1.5 mL Microcentrifuge tube	Fisherbrand	05-408-129
10-cm Tissue culture dish	Greiner Bio-One	664160	CELLSTAR
15 mL Centrifuge tube	Fisherbrand	07-200-886
2 L Beaker	Fisherbrand	02-591-33
24-well Tissue culture plate	Greiner Bio-One	662160	CELLSTAR
25 mL Reagent reservoir	Genesee Scientific Corporation	28-121
500 mL Beaker	Fisherbrand	02-591-30
6-cm Tissue culture dish	Greiner Bio-One	628160	CELLSTAR
8-Channel aspiration adapter	Integra Biosciences	155503
8-Channel aspiration adapter for standard tips	Integra Biosciences	159024
95% Ethanol	Decon Laboratories Inc	4355226
Ammonia-free glass cleaner	Sparkle	FUN20500CT
Black 96-well high-content screening microplate	PerkinElmer	6055300	CellCarrier-96 Ultra
Cotton-tipped applicator	Fisherbrand	23-400-101
Coverslips	Fisherbrand	12-545-80	12 mm diameter
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader	Biotek	CYT5FW
DAPI	Millipore Sigma	5.08741
Dextran 70 kDa – FITC	Life Technologies	D1822	Lysine-fixable
Dextran 70 kDa – TMR	Life Technologies	D1819
DMSO	Millipore Sigma	D1435
DPBS	Corning	21031CV	Without Calcium and Magnesium
Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dumont #5
Formaldehyde, 37%	Ricca Chemical	RSOF0010-250A	ACS Reagent Grade
Glycerol	Fisher BioReagents	BP229-1
Hardening fluorescence mounting media	Agilent Tech	S302380-2	DAKO
Hoechst 33342	Millipore Sigma	B2261
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher Chemical	A144-212	Certified ACS Plus, 36.5%–38.0%
Lint-free wipes	Kimberly-Clark	34155	Kimwipes
Miscroscope slides	Fisherbrand	12-544-1	Premium plain glass
Multichannel pipette	Gilson	FA10013	8 channels, 0.5–10 µL
Multichannel pipette	Gilson	FA10012	12 channels, 20–200 µL
Multichannel pipette	Gilson	FA10011	8 channels, 20–200 µL
Parafilm M	Pechiney	PM996
Plastic wrap	Kirkland Signature	208733	Stretch-Tite
Silicone isolators	Grace Bio Labs Inc	664107	13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm
Slide adapter	Biotek	1220548
Wash bottle	Fisherbrand	FB0340922C