공초점 현미경 화상 진찰 분석을 통해 세포외 소포 Uptake 분석
Summary
세포 외 소포 (전기)는 세포 생물학 및 세포 간 통신에 기여합니다. 세포에 의한 전기자동차 의 섭취를 시각화하고 정량화하기 위한 실용적인 에세이의 필요성이 있다. 현재 프로토콜은 나노 여과 계 미세 유체 장치에 의한 EV 절연에 따라 공초점 현미경 검사를 통해 3차원 형광 이미징을 활용하여 EV uptake 분석법을 제안합니다.
Abstract
세포의 세포 외 소포 (EV) 섭취량을 시각화하고 정량화하기 위한 실용적인 에세이가 필요합니다. EV 섭취량은 다양한 연구 분야에서 세포간 통신에 중요한 역할을 합니다. 암 생물학, 신경 과학 및 약물 전달. 많은 EV 섭취량 은 문학에서 보고되었습니다. 그러나 실용적이고 상세한 실험 방법론이 부족합니다. EV 섭취량은 형광 라벨을 부착하여 세포 내의 위치를 감지하여 평가할 수 있습니다. 세포의 내이화 된 전기와 셀의 피상적 인 전기를 구별하는 것은 EV 섭취량을 정확하게 결정하는 것이 어렵지만 중요합니다. 따라서, 3차원(3D) 형광 공초점 현미경을 통해 EV 의 섭취를 효율적으로 정량화하는 분석이 이 작품에서 제안된다. 형광 라벨이 부착된 전기는 나노 여과 계 미세 유체 장치를 사용하여 제조되었으며, 3D 공초점 현미경검사법에 의해 시각화된 다음 고급 이미지 처리 소프트웨어를 통해 분석하였다. 이 프로토콜은 셀룰러 수준에서 전기를 분석하기 위한 강력한 방법론과 효율적인 분석을 위한 실용적인 접근 방식을 제공합니다.
Introduction
세포외 소포(EV)는 나노 크기의 지질 막 결합 입자로, 이독(100-500 nm) 및 엑소좀(50-150 nm)1의 크기로 분류된다. 전기 는 단백질, 핵산 및 지질과 같은 다양한 생체 분자를 포함합니다. 이 생체 분자는 화물로 캡슐화 되고 EVs1,2,3을 통해 세포 외 공간으로 방출되기 전에 세포에서 유래합니다.
그들의 화물의 다양성때문에, 전기는 세포 간 통신에 적극적인 역할을 하는 것으로 여겨진다. 세포별 전기자동차의 방출 및 섭취는 세포 4,5 사이의 생체 분자의 전달을 허용한다. 셀에 EV 화물을 도입하면 수신자 셀의 기능 및 근종 상태를 변경할 수 있습니다4,5,6. 전기 자동차는 여러 경로를 통해 내면화됩니다. 그러나 정확한 메커니즘은 정확하게 입증되지 않았습니다.
유전 적 태깅, 형광 라벨 개별 EVs7과 같은 EV 섭취량 소의 대다수. 결과 신호는 마이크로 플레이트 광미터, 유동 세포측정법 또는 현미경 검사법으로 측정할 수 있으며 각 기술은 상당한 한계를 가지고 있습니다. 마이크로 플레이트 광계, 유동 세포측정, 또는 표준 2차원(2D) 현미경 검사는 내재및 피상적으로 부착된 EV8,9을 구별할 수 없다. 또한 이러한 각 기술에 필요한 샘플 준비는 EV uptake 평가에 추가 적인 문제를 야기할 수 있습니다. 예를 들어, EV 섭취량 분석 전에 트립신으로 부착된 셀을 리프팅하면 셀 표면에 일부 피상적으로 부착된 EV가 갈라질 수 있습니다10,11. 트립신은 또한 세포 표면과 상호 작용할 수 있습니다., 세포 및 EV 표현형에 영향을 미치는. 또한 트립신은 피상적 인 전기 를 완전히 분리하여 격리 된 인구를 왜곡하지 않을 수 있습니다.
형광염염으로 전기자동차에 정확하게 라벨을 붙이려면 잔류 염료7을 제거하기 위해 추가 세척 단계가 필요합니다. 허용된 격리 기술은 EV 격리 중에 발생하는 응고로 인한 거짓 긍정 신호에도 기여할 수 있습니다. 예를 들어, 직렬 초원심분리(UC)는 널리 전기를 분리하고 고정된 염료를 제거하는 데 사용된다. 그러나, UC는 전기자동차를 공동 침전시킬 수 있으며, 잔류염은 거짓 양성 신호12,13로 이어질 수 있다. 컬럼 계 여과와 같은 다른 나노 여과 방법도 비 고정 염료 제거에 널리 사용됩니다. 컬럼 매트릭스 내에서 상호 작용하는 전기 및 염료의 복잡한 특성은 복잡한 입력14,15,16에 의해 변경되는 컬럼의 분자 차단으로 인해 잔류 염료의 불완전한 제거로 이어질 수 있다.
현재 프로토콜은 형광 으로 표시된 절연 된 전기 를 분리하고 세척하기 위해 나노 여과 기반 의 미세 유체 장치를 제안합니다. 나노 여과 기반 의 미세 유체 장치는 유체 보조 분리 기술 (FAST)17,18을 통해 효율적인 여과를 제공 할 수 있습니다. FAST는 필터 전체의 압력 강하를 줄여 EV와 염료 간의 잠재적 집계를 줄입니다. 잔류 염료를 효율적으로 제거함으로써 형광라벨이 부착된 EV의 품질과 분석의 특이성을 향상시킬 수 있습니다.
공초점 현미경 검사는 세포 표면에 내재화 및 피상적으로 부착된 EV를 구별하고 지각 측량 해상도19,20,21,22,23,24,25에서 EV 섭취량의 세포 메커니즘을 포괄적으로 조사할 수 있다. 예를 들어, Sung et al.은 개발된 라이브 셀 리포터를 사용하여 엑소솜 라이프사이클의 시각화를 설명했습니다. 내부화된 전기자동차의 위치는 공초점 현미경을 3차원(3D) 및 후이미지 처리 툴20으로 검출및 분석하였다. 소형 전기자동차(40-200nm)의 크기는 광학 현미경의 해상도 한계 미만이지만, 광검출기가 향상된 형광 방출을 감지할 수 있기 때문에 형광표시 전기자동차는 공초점 현미경으로 검출될 수 있다. 따라서, 세포 내형 표지된 전기자동차의 세포세포 소중화는 전기자동차와 주변 세포 기관의 여러 z-stacked 이미지를 획득함으로써 정확하게 결정될 수 있다.
또한 3D 재구성 및 사후 데이터 처리는 내부화, 피상적 및 자유 부동 EV의 위치에 대한 추가 통찰력을 제공할 수 있습니다. 공초점 현미경 검사법에 의해 제공되는 시간 경과 라이브 셀 이미징과 함께 이러한 프로세스를 활용하여 EV 섭취량의 수준을 정확하게 평가할 수 있으며 EV 섭취량의 실시간 추적도 가능합니다. 또한, EV 인신 매매 분석은 세포내 기능에 내재된 전기자동차가 어떻게 관여하는지 결정하는 첫 번째 단계인 세포기관과 함께 전기자동차의 공동 국소화를 평가함으로써 공초점 현미경을 사용하여 수행될 수 있다. 이 프로토콜은 나노 여과 계 미세 유체 장치17,26, 공초점 현미경 검사법 및 사후 이미지 분석을 사용하여 EV 섭취량 분석을 수행하는 방법론을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
공초점 현미경 검사를 통한 3D 형광 이미징을 기반으로 하는 EV 섭취 분석법은 효율적인 방법론과 민감한 분석을 제공합니다. 이 형광 EV 라벨링은 EV의 시각화를 용이하게 하고 정확한 EV 업테이크 분석기를 성공적으로 수행합니다. EV 라벨링 및 잔류 염료 를 제거하기위한 이전 방법은 초음파 심립분리 (UC)를 사용하여 침전을 제거하여보고되었습니다. 그러나, UC는 전기자동차를 공동 침전시?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NCI 보조금 Nos에 의해 지원되었다. U54CA143803, CA163124, CA093900 및 CA143055 ~ K. J. P. 이 연구는 한국보건복지부의 지원을 받아 한국보건산업개발원(KHIDI)을 통해 한국보건기술R&D 사업의 지원(교부금 번호: HI19C1122)에 의해 지원되었다. 김제이와 Y.K. 조 대표는 한국 정부의 지원을 받아 기초과학연구소(IBS-R020-D1)의 지원을 받았다. 저자는 원고의 비판적 독서에 대한 브래디 비뇨기과 연구소의 현재와 과거 회원, 특히 피엔타 – 수정 연구소의 구성원을 감사드립니다.
Materials
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain – 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
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