Ekstracellulære vesikel Optagelse Assay via Confocal Microscope Imaging Analyse
Summary
Ekstracellulære vesikler (elbiler) bidrager til cellulær biologi og intercellulær kommunikation. Der er behov for praktiske analyser til at visualisere og kvantificere elbiler optagelse af cellerne. Den nuværende protokol foreslår EV optagelse assay ved hjælp af tre-dimensionelle fluorescens billeddannelse via konfokal mikroskopi, efter EV isolation af en nano-filtrering-baseret mikrofluidisk enhed.
Abstract
Der er behov for praktiske analyser til at visualisere og kvantificere cellernes ekstracellulære vesikel (EV) optagelse. Udbredelsen af el-og el-eks. kræftbiologi, neurovidenskab og lægemiddellevering. Mange EV optagelse assays er blevet rapporteret i litteraturen; Der mangler imidlertid en praktisk og detaljeret eksperimentel metode. EV optagelse kan vurderes ved fluorescerende mærkning elbiler til at opdage deres placering i celler. Det er vanskeligt, men kritisk at skelne mellem internaliserede elbiler i celler og de overfladiske elbiler på celler, men det er vigtigt at bestemme EV-optagelsen nøjagtigt. Derfor foreslås en analyse, der effektivt kvantificerer EV-optagelse gennem tredimensionel (3D) fluorescenskonfokal mikroskopi i dette arbejde. Fluorescerende mærket elbiler blev udarbejdet ved hjælp af en nano-filtrering-baseret mikrofluidisk enhed, visualiseret af 3D konfokal mikroskopi, og derefter analyseret gennem avanceret billedbehandling software. Protokollen giver en robust metode til analyse af elbiler på celleniveau og en praktisk tilgang til effektiv analyse.
Introduction
Ekstracellulære vesikler (elbiler) er nano-størrelse, lipidmembran-bundet partikler, der er kategoriseret efter deres størrelser: ectosomes (100-500 nm) og exosomer (50-150 nm)1. Elbiler indeholder forskellige biomolekyler, såsom proteiner, nukleinsyrer og lipider. Disse biomolekyler stammer fra cellerne, før de indkapsles som last og frigives i det ekstracellulære rum via elbiler1,2,3.
På grund af de mange forskellige deres last, elbiler menes at spille en aktiv rolle i intercellulær kommunikation. Frigivelse og optagelse af elbiler af celler gør det muligt at overføre biomolekyler mellem cellerne4,5. Indførelsen af EV-last til en celle kan ændre modtagercellens funktioner og homøostatisk tilstand4,5,6. Elbiler internaliseres gennem flere veje; De nøjagtige mekanismer er dog ikke blevet nøjagtigt påvist.
De fleste af ev optagelse assays, såsom genetisk mærkning, fluorescerende mærke individuelle elbiler7. Det resulterende signal kan måles ved mikropladefotometer, flowcytometri eller mikroskopi, hvor hver teknologi har betydelige begrænsninger. Mikropladefotometre, flowcytometri eller standard todimensionel (2D) mikroskopi kan ikke skelne mellem internaliserede og overfladisk vedhæftede elbiler8,9. Desuden kan den nødvendige prøveforberedelse for hver af disse teknikker medføre yderligere problemer i forbindelse med evaluering af ev-optagelse. For eksempel, løfte klæbede celler med trypsin før EV optagelse analyse kan kløve nogle overfladisk vedhæftede elbiler på cellens overflade10,11. Trypsin kan også interagere med celleoverfladen, påvirker celle og EV fænotype. Derudover kan trypsin ikke løsne overfladiske elbiler helt, skævvridning isolerede populationer.
For nøjagtigt at mærke elbiler med fluorescerende farvestoffer kræves der yderligere vasketrin for at fjerne restfarvet7. Accepterede isolationsteknikker kan også bidrage til falsk-positive signaler på grund af koagulation, der opstår under EV-isolation. For eksempel er seriel ultracentrifugering (UC) meget udbredt til at isolere elbiler og fjerne det immobiliserede farvestof. UC kan dog være med til at udfælde elbiler, og restfarvestoffet kan føre til et falsk-positivt signal12,13. Andre nanofiltreringsmetoder, såsom kolonnebaseret filtrering, anvendes også i vid udstrækning til ikke-immobiliseret farvefjernelse. Den komplekse karakter af elbiler og farvestof, der interagerer inden for kolonnematrixen, kan føre til ufuldstændig fjernelse af restfarvestof, fordi søjlens molekylære afskæring ændres af den komplekse indgang14,15,16.
Den nuværende protokol foreslår en nanofiltreringsbaseret mikrofluidisk enhed til at isolere og vaske fluorescerende mærket isolerede elbiler. Den nanofiltreringsbaserede mikrofluidiske enhed kan give effektiv filtrering via væskeassisteret separationsteknologi (FAST)17,18. FAST reducerer trykfaldet på tværs af filteret, hvilket reducerer den potentielle sammenlægning mellem elbiler og farvestoffer. Ved effektivt at fjerne restfarve, er det muligt at forbedre kvaliteten af fluorescerende mærket elbiler og analysens specificitet.
Konfokal mikroskopi kan skelne mellem internaliserede og overfladisk vedhæftede elbiler på celleoverfladen og grundigt undersøge de cellulære mekanismer af EV optagelse i en spatiotemporal opløsning19,20,21,22,23,24,25. For eksempel beskrev Sung et al. visualiseringen af den exosome livscyklus ved hjælp af deres udviklede live-celle reporter. Placeringen af de internaliserede elbiler blev opdaget og analyseret ved hjælp af et konfokalt mikroskop i 3D-værktøjer (three-dimension) og post-image processing20. Selv om størrelsen af små elbiler (40-200 nm) er under opløsningsgrænsen for det optiske mikroskop, kan de fluorescerende mærkede elbiler detekteres ved konfokal mikroskopi, da fotodetektoren kan detektere den forbedrede fluorescensemission. Derfor kan den subcellulære lokalisering af de fluorescerende mærkede elbiler i en celle bestemmes præcist ved at erhverve flere z-stablede billeder af elbilerne og de omkringliggende cellulære organeller.
Derudover kan 3D-rekonstruktion og post-databehandling give yderligere indsigt i placeringen af de internaliserede, overfladiske og fritflydende elbiler. Ved at udnytte disse processer i forbindelse med time-lapse live-celle billeddannelse, der tilbydes af konfokal mikroskopi, kan niveauet af EV optagelse vurderes præcist, og real-time tracking af EV optagelse er også muligt. Endvidere kan ev trafficking analyse udføres ved hjælp af konfokal mikroskopi ved at vurdere co-lokalisering af elbiler med organeller, et første skridt til at bestemme, hvordan internaliserede elbiler er involveret i den intracellulære funktion. Denne protokol beskriver metoden til udførelse af en EV-optagelsesanalyse ved hjælp af den nanofiltreringsbaserede mikrofluidiske enhed17,26, konfokal mikroskopi og analyse efter billede.
Protocol
Representative Results
Discussion
En EV optagelse assay baseret på 3D fluorescens billeddannelse via konfokal mikroskopi giver en effektiv metode og følsom analyse. Denne fluorescerende EV mærkning letter visualisering af elbiler og med succes udfører en præcis EV optagelse assay. Tidligere metoder til mærkning af elbiler og fjernelse af restfarvestof er blevet rapporteret ved at fjerne nedbør ved hjælp af ultracentrifugering (UC); UC kan dog være med til at udfælde elbiler, og det immobiliserede farvestof kan føre til et falsk-positi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIC-tilskudsnr. U54CA143803, CA163124, CA093900 og CA143055 til K.J.P. Denne forskning blev støttet af en bevilling fra Korea Health Technology R &D Project gennem Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansieret af Ministeriet for Sundhed og Velfærd, Republikken Korea (tilskudsnummer: HI19C1122). Arbejde af J. Kim og Y.-K. Cho blev støttet af Institute for Basic Science (IBS-R020-D1), finansieret af den koreanske regering. Forfatterne takker de nuværende og tidligere medlemmer af Brady Urological Institute, især medlemmer af Pienta-Amend laboratoriet, for den kritiske læsning af manuskriptet.
Materials
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain – 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
References
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -. K., Cho, Y. -. K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics. The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).
- Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Bonsergent, E., et al. Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells. Nature Communications. 12, 1864 (2021).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods Enzymology. 645, 15-42 (2020).
- Ragni, E., et al. Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments. Cells. 9 (5), 1180 (2020).
- Saari, H., et al. FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel. Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).
- Franzen, C. A., et al. Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells. BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).
- Feng, D., et al. Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Hoen, E. N. M. N. -. T., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van Der Vlist, E. J., Nolte-‘T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Singh, K., et al. Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges. The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).
- Woo, H. -. K., et al. Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples. ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).
- Kim, T. -. H., et al. FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface. Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).
- Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Sung, B. H., et al. A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells. Nature Communications. 11, 2092 (2020).
- Heusermann, W., et al. Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER. Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).
- Reclusa, P., et al. Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion. Scientific Reports. 10, 6494 (2020).
- Verweij, F. J., et al. Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo. Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., Stępień, E. 3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells. Cellular & Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).
- Sunkara, V., et al. Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring. Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).
- Li, H., et al. Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).
- Dong, L., et al. Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium. Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).
